新型結(jié)構(gòu)PLGA-膠原三維可降解復(fù)合材料用于軟骨再生的效果研究.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、第一部分 PLGA/Collagen復(fù)合材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)與制備
  目的:設(shè)計(jì)和制備新型結(jié)構(gòu)的PLGA/Collagen復(fù)合材料,使之更適合作為組織工程支架用于再生醫(yī)學(xué)研究。
  方法:通過模具設(shè)計(jì),控制PLGA/Collagen復(fù)合材料立體結(jié)構(gòu),利用冷凍干燥技術(shù)將膠原多孔海綿復(fù)合于PLGA編織網(wǎng)膜上。材料按不同結(jié)構(gòu)分為三組:(1)THIN型,多孔膠原海綿形成于PLGA編織網(wǎng)膜的網(wǎng)孔中;(2)SEMI型,多孔膠原海綿形成于PLG

2、A編織網(wǎng)膜的網(wǎng)孔中和單側(cè);(3)SANDWICH型,多孔膠原海綿形成于PLGA編織網(wǎng)膜的網(wǎng)孔中和兩側(cè)。材料制備完成后行掃描電鏡觀察材料表面和橫截面微觀結(jié)構(gòu),利用圖像軟件統(tǒng)計(jì)孔徑大小,測(cè)定吸水率和膨脹率測(cè)定。
  結(jié)果:成功構(gòu)建THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復(fù)合材料,表面孔徑分別為136.4±11.8μm、142.9±15.3μm和139.6±12.5μm;SEMI和SANDWICH型PLGA/Co

3、llagen復(fù)合材料吸水率分別為12.9±1.71和13.6±2.3倍,明顯優(yōu)于THIN型材料(4.4±0.4)(P<0.001),結(jié)構(gòu)符合設(shè)計(jì)要求。
  結(jié)論:新構(gòu)建的SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復(fù)合材料結(jié)構(gòu)和表面孔徑滿足軟骨組織工程研究的需要;能為軟骨再生提供更大的細(xì)胞容納能力和組織再生空間。
  第二部分 PLGA/Collagen復(fù)合材料用于軟骨再生的體外研究
  目的:觀察和比較不同

4、結(jié)構(gòu)的THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復(fù)合材料在體外對(duì)牛軟骨細(xì)胞增殖分泌的效果。
  方法:分離與培養(yǎng)牛膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(BACs),倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。擴(kuò)增至第2代時(shí)接種至三種PLGA/Collagcn復(fù)合材料,(1)THIN/BACs組,細(xì)胞接種于THIN型PLGA/Collagen復(fù)合材料;(2)SEMI/BACs組,細(xì)胞接種于SEMI型PLGA/Collagen復(fù)合材料;(3)SA

5、NDWICH/BACs組,細(xì)胞接種于SANDWICH型PLGA/Collagen復(fù)合材料,檢測(cè)細(xì)胞接種效率。掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面和內(nèi)部的生長(zhǎng)情況;體外培養(yǎng)一周后檢測(cè)BACs/材料復(fù)合內(nèi)DNA和GAG含量,Real-time PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan mRNA表達(dá)強(qiáng)度。牛膝關(guān)節(jié)軟骨組織和體外單層培養(yǎng)一周的P1 BACs做對(duì)照。
  結(jié)果:BACs成功地分離與擴(kuò)增,生長(zhǎng)與增殖情況良好;P2 BACs接種至P

6、LGA/Collagen復(fù)合材料,平均接種效率在SEMI、SANDWICH組分別為87.8±1.6%、95.6±2.2%,顯著高于THIN組(P<0.05)。掃描電鏡觀察BACs在PLGA/Collagen復(fù)合材料表面和中心生長(zhǎng)活躍,分布均勻;一周后標(biāo)本檢測(cè)DNA含量SEMI、SANDWICH組顯著高于THIN組(P<0.05),但GAG含量與無(wú)明顯差異。三組細(xì)胞/材料復(fù)合物Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于體外單純

7、培養(yǎng)的BACs,但SEMI、SANDWICH組與THIN組相比亦無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
  結(jié)論:PLGA/Collagen復(fù)合材料具備優(yōu)秀的生物相容性;SEMI、SANDWICH組的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)顯著地提高BACs在PLGA/Collagen復(fù)合材料上的接種效率;SEMI、SANDWICH組較THIN組明顯促進(jìn)透明軟骨樣ECM成分分泌。
  第三部分 PLGA/Collagen復(fù)合材料用于軟骨再生的體內(nèi)研究
  目的:觀察和比

8、較不同結(jié)構(gòu)的THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復(fù)合材料在體內(nèi)對(duì)牛軟骨細(xì)胞成軟骨的效果。
  方法:P2 BACs接種至THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復(fù)合材料,(1)THIN/BACs組,細(xì)胞接種于THIN型復(fù)合材料;(2)SEMI/BACs組,細(xì)胞接種于SEMI型復(fù)合材料;(3)SANDWICH/BACs組,細(xì)胞接種于SADWICH型復(fù)合材料;(4)對(duì)照組,隨機(jī)選擇空

9、白THIN、SEMI、SANDWICH型復(fù)合材料,體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后植入裸鼠背部皮下。2、4、8周后取出行標(biāo)本大體觀察,厚度測(cè)量。檢測(cè)新生軟骨樣組織內(nèi)DNA和GAG含量,Real-time PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan mRNA表達(dá)強(qiáng)度;對(duì)標(biāo)本縱切面和橫切面行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)檢測(cè);并以生物力學(xué)方法評(píng)估標(biāo)本的彈性模量和剛度。牛膝關(guān)節(jié)軟骨組織做對(duì)照。
  結(jié)果:2、4、8周后取出標(biāo)本,三組BACs/材料

10、復(fù)合物均呈透明軟骨樣外觀而空白對(duì)照組至第8周時(shí)基本被吸收。SEMI/BACs、SANDWICH/BACs組新生軟骨的厚度分別為THIN/BACs組的1.66和1.73倍(P<0.05)。三組標(biāo)本的DNA含量非常接近,但SEMI/BACs、SANDWICH/BACs組μgDNA的GAG含量顯著地高于THIN/BACs組(p<0.05),分別為牛膝關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本的60.1%、52.1%和26.6%。Real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)標(biāo)本內(nèi)Ⅱ型

11、膠原、Aggrecan mRNA表達(dá)強(qiáng)度隨移植時(shí)間進(jìn)行性上升,而Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行性下降;組織學(xué)和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分布均勻,大量透明軟骨樣ECM形成。SEMI/BACs、SANDWICH/BACs組標(biāo)本的彈性模量分別達(dá)到了牛膝關(guān)節(jié)軟骨的54.8%、49.3%,剛度達(dá)到了68.8%、62.7%。
  結(jié)論:PLGA/Collagen復(fù)合材料植入裸鼠體內(nèi)后呈現(xiàn)了優(yōu)秀的生物相容性;新設(shè)計(jì)的SEMI和SANDWICH材料較T

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