多種途徑誘生抑制性樹突狀細胞及其產生免疫抑制的機制研究.pdf

1、第一部分:CD80/CD86基因RNA干擾慢病毒載體誘生抑制性樹突狀細胞及其產生免疫抑制的研究
　　目的:本實驗旨在研究經RNA干擾后，受者來源的抑制性樹突狀細胞(Dentriticcell，DC)在間接識別通路中產生免疫抑制活性的相關機制。
　　方法:在受者C3H小鼠骨髓來源DC培養(yǎng)過程中，加入供者C57BL/6小鼠脾臟來源的抗原，通過CD80/CD86基因RNA干擾慢病毒感染負載供者抗原的受者DC。通過流式細胞技術檢測其

2、表面分子CD80和CD86的表達情況。并將該DC與C3H小鼠脾臟T細胞進行混合淋巴細胞反應(Mixed lymphocyte reaction，MLR)，檢測T細胞增殖情況。通過酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測MLR上清液中的細胞因子IL-2、 IL-4、 IL-10及干擾素γ(Interferon-γ，INF-γ)的表達水平。通過Annexin V/CD3雙染色法檢測間接識別通路中T細胞的凋亡情況。結果:相較對照組及空白組而言，CD8

3、0/CD86基因RNA干擾慢病毒感染組可明顯抑制DC表面共刺激分子CD80和CD86的表達(P＜0.05)，并可以得到穩(wěn)定的抑制性DC。在MLR中，使用慢病毒處理受者DC能夠有效減弱對受者T細胞增殖的刺激作用。ELISA結果提示，培養(yǎng)上清中Th1細胞因子(IL-2和INF-γ)的含量明顯減少，而Th2細胞因子(IL-10)的含量顯著增高(P＜0.05)，IL-4表達水平無明顯差異（P＞0.05）。并且發(fā)現抑制性DC可以顯著誘導T細胞凋亡

4、(P＜0.05)。
　　結論:慢病毒載體介導的RNA干擾方法可以有效誘導CD80及CD86低表達的抑制性DC的生成。這種抑制性DC可以通過誘導T細胞凋亡的方式產生重要的免疫抑制活性。
　　第二部分:肝星狀細胞誘生抑制性樹突狀細胞及其產生免疫抑制的研究
　　目的:研究INF-γ促進肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)表達B7-H1及其相關信號通路，進一步研究HSC誘生抑制性DC并產生免疫抑制的

5、相關機制。
　　方法:在INF-γ活化C57BL/6小鼠HSC的過程中，我們將不同濃度的INF-γ作用于HSC，將恒定濃度的INF-γ與HSC作用0.5～48hrs。同時，利用INF-γ刺激INF-γ R1基因敲除及Stat1基因敲除小鼠的HSC。在此HSC活化過程中，還加入蛋白合成抑制劑(CHX)、RNA合成抑制劑(ActD)及信號通路抑制劑(U0126、SP600125和LY294002)，分別利用流式細胞儀及RT-PCR檢測

6、INF-γ促進HSC表達B7-H1情況。通過Western blot檢測HSC中ERK1/2磷酸化情況。在C57BL/6小鼠骨髓來源DC培養(yǎng)過程中，加入活化的C57BL/6小鼠HSC。通過流式細胞技術檢測DC表面分子CD80和CD86的表達情況。將該DC與BALB/c小鼠脾臟T細胞進行MLR，檢測T細胞增殖情況。通過Annexin V/CD3雙染色法檢測MLR中T細胞凋亡的情況。
　　結果:經INF-γ活化后，HSC表達B7-H1

7、顯著增加，且和INF-γ活化時間及濃度成正相關。INF-γ R1及Stat1基因敲除小鼠來源的HSC經INF-γ活化后幾乎不表達B7-H1。ActD可以阻斷B7-H1 mRNA的合成，而CHX對B7-H1 mRNA的合成無影響。阻斷PI3K信號通路抑制劑LY294002對INF-γ活化HSC促進B7-H1的表達無影響，而阻斷MEK1/2信號通路抑制劑U0126可以顯著抑制B7-H1的表達。阻斷JNK信號通路抑制劑SP600125可輕度減

8、少B7-H1的表達。Western blot檢測發(fā)現，經INF-γ活化的HSCs中ERK1/2發(fā)生磷酸化。激活后的HSC可以抑制DC表面分子CD80和CD86的表達。在MLR中，經活化的HSC處理的DC能夠有效減弱對T細胞增殖的刺激作用。并且發(fā)現這些抑制性DC可以顯著誘導T細胞凋亡。
　　結論:INF-γ通過MEK/ERK信號通路促進HSC高表達B7-H1。經INF-γ活化的HSC可誘導抑制性DC生成，且此抑制性DC可通過誘導T細