人脾臟基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)新型調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的產(chǎn)生及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cell，DC)被認(rèn)為是目前已知的功能最強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，能夠感知、整合一系列的外來(lái)病原體信號(hào)并將其傳遞給淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)適度的免疫應(yīng)答反應(yīng)以清除入侵機(jī)體的病原體。未成熟DC在微生物感染或移植后識(shí)別、吞噬外源性抗原，可快速成熟。DC成熟后吞噬能力減弱，但細(xì)胞表面共刺激分子和粘附分子的表達(dá)上調(diào)，并分泌促炎癥細(xì)胞因子，啟動(dòng)初始的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)

2、答反應(yīng)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明DC是一種異質(zhì)性的細(xì)胞群體，分布于不同的解剖部位，含有不同的細(xì)胞亞群，處于不同的成熟階段，表達(dá)不同的表型和細(xì)胞因子，其功能也是多樣性的。其中，具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的DC亞群的發(fā)現(xiàn)及其功能特點(diǎn)與作用機(jī)制的研究是該領(lǐng)域近年來(lái)的重要進(jìn)展之一，此類(lèi)具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的DC亞群被稱(chēng)為調(diào)節(jié)性DC(Regulatroy DC)。目前認(rèn)為，調(diào)節(jié)性DC主要通過(guò)選擇性的誘導(dǎo)Th2型的免疫應(yīng)答或促使初始CD4+和CD8+T

3、細(xì)胞分化為分泌IL-10的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來(lái)負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答。
　　 在前期的研究中，以小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，我們發(fā)現(xiàn)以往被認(rèn)為終末分化細(xì)胞的成熟DC，與小鼠脾臟基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后能夠進(jìn)一步增殖并分化為一類(lèi)能夠通過(guò)分泌NO而抑制T細(xì)胞增殖的新型調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞，我們將之命名為“分化樣樹(shù)突狀細(xì)胞”(Differentiated dendritic cell，diffDC)，從而提出了成熟DC并非均為終末分化細(xì)胞的觀點(diǎn)，其在完成了抗原遞呈任務(wù)之

4、后，在次級(jí)淋巴器官微環(huán)境的作用下，仍能夠進(jìn)一步增殖分化，從而被賦予了新的生命與功能。在不同的生理或病理情況下，diffDC與周?chē)芏嗝庖呒?xì)胞存在相互作用，彼此精密調(diào)節(jié)，例如可以通過(guò)分泌IL-10活化NK細(xì)胞而促進(jìn)其殺傷能力，并通過(guò)分泌IP-10選擇性地趨化Th1細(xì)胞并抑制其增殖，從而維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。然而，上述觀點(diǎn)都是來(lái)自于針對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在人體內(nèi)成熟樹(shù)突狀細(xì)胞與脾臟基質(zhì)微環(huán)境又是如何作用的呢?是否會(huì)產(chǎn)生像小鼠diffDC那樣的具有負(fù)

5、向調(diào)節(jié)功能的人樹(shù)突狀細(xì)胞亞群呢?如果真有這樣一種人DC亞群，其生物學(xué)意義及其相關(guān)的作用機(jī)制又是什么呢?
　　 鑒于本課題本質(zhì)為兩種細(xì)胞的相互作用，我們?cè)诒狙芯恐蟹譃槿糠謨?nèi)容，分別圍繞脾臟基質(zhì)細(xì)胞系的建立、新型人調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的特點(diǎn)與功能以及該細(xì)胞亞群的人體內(nèi)驗(yàn)證三方面進(jìn)行探討。
　　 一、人脾臟基質(zhì)細(xì)胞系HESSCs的建立與鑒定
　　 首先，我們分離4-6月引產(chǎn)胎兒新鮮脾臟，用組織培養(yǎng)法培養(yǎng)脾臟基質(zhì)細(xì)胞。

6、大約一個(gè)月左右，貼壁生長(zhǎng)的基質(zhì)細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板，消化傳代后形成最初的脾臟基質(zhì)細(xì)胞系。此時(shí)的脾臟基質(zhì)細(xì)胞系在鏡下觀察可見(jiàn)由數(shù)種形態(tài)、大小不一的細(xì)胞組成，純度不佳。隨著進(jìn)一步的培養(yǎng)，逐步純化為主要由內(nèi)皮狀細(xì)胞組成的基質(zhì)細(xì)胞系，細(xì)胞生長(zhǎng)速度趨于穩(wěn)定，如此經(jīng)過(guò)大約2-3月的培養(yǎng)后，形成穩(wěn)定的脾臟基質(zhì)細(xì)胞系。
　　 接下來(lái)，我們對(duì)所建的人類(lèi)脾臟基質(zhì)細(xì)胞系進(jìn)行了初步鑒定，通過(guò)流式檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系主要是由CD105+的內(nèi)皮細(xì)胞組成，不表達(dá)C

7、D11c、CD11b等髓系細(xì)胞標(biāo)志。mRNA分析表明該基質(zhì)細(xì)胞系以?xún)?nèi)皮型細(xì)胞為主，檢測(cè)通過(guò)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系分泌較高的TGF-β，提示該細(xì)胞系可能具有一定的誘導(dǎo)分化能力，因此我們構(gòu)建的脾臟基質(zhì)細(xì)胞系是一群主要由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的具有潛在誘導(dǎo)分化能力的基質(zhì)細(xì)胞系，我們稱(chēng)其為HESSCs(Human Endothelial-like Spleen Stromal Cells)。
　　 二、HESSCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的新型人調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀

8、細(xì)胞亞群的特點(diǎn)與功能
　　 在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們著重研究了由人脾臟基質(zhì)細(xì)胞系HESSCs誘導(dǎo)的，從人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞分化而來(lái)的CD11bhiCTLA-4+新型人調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的特點(diǎn)與功能。
　　 首先，我們從正常人外周血樣本分離得到人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，進(jìn)一步純化為CD14+單核細(xì)胞，用GM-CSF及IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)其分化為典型的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(imDC)，再用TLR配體LPS刺激其分

9、化為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(maDC)后，將該maDC與之前建立的脾臟基質(zhì)細(xì)胞系HESSC混合培養(yǎng)，觀察二者之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，去除誘導(dǎo)性細(xì)胞因子GM-CSF及IL-4后，對(duì)照培養(yǎng)基中的maDC大部分在1-2周內(nèi)凋亡或死亡，而大部分與HESSCs混合培養(yǎng)的樹(shù)突狀細(xì)胞依舊存活，說(shuō)明HESSCs支持單核細(xì)胞來(lái)源的maDC的存活。
　　 基于上述現(xiàn)象，我們選定與HESSC共培養(yǎng)1-2周后的maDC作為研究對(duì)象，進(jìn)行表型與功能方面的檢測(cè)。

10、經(jīng)流式分析發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞相對(duì)于maDC主要表現(xiàn)為CD11clow、CD11bhi、HLA-DRlow、CD80low、CD83low、CD86low及CTLA-4+，同時(shí)細(xì)胞因子檢測(cè)證實(shí)該群細(xì)胞高分泌PGE2、TGF-β，然而目前尚未發(fā)現(xiàn)該群細(xì)胞能夠分泌較高的IL-1O、NO等負(fù)向調(diào)節(jié)因子。令人感興趣的是，該群細(xì)胞表達(dá)抑制性受體CTLA-4，加之其又能分泌高水平的PGE2、TGF-β等負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，提示該群新型樹(shù)突狀細(xì)胞亞群可能發(fā)揮著

11、一定的免疫抑制功能。通過(guò)對(duì)maDC及該新型樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的mRNA進(jìn)行分析對(duì)比，驗(yàn)證了該群新型樹(shù)突狀細(xì)胞亞群TGF-β、CTLA-4的mRNA表達(dá)水平都明顯高于maDC，同時(shí)尚未發(fā)現(xiàn)該樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的IL-10、PD-1、PDL-1、PDL-2等重要分子的mRNA水平有明顯增高。
　　 樹(shù)突狀細(xì)胞作為最主要的抗原提呈細(xì)胞，在炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，那么我們這群新型的樹(shù)突狀細(xì)胞亞群在炎癥狀態(tài)下又有怎樣的反應(yīng)昵?實(shí)

12、驗(yàn)證明，該新型樹(shù)突狀細(xì)胞亞群與maDC相比在TLR4配體LPS刺激后，能夠分泌高水平的炎性細(xì)胞因子，包括IL-10、TNF-α、PGE2、TGF-β等。這一結(jié)果提示我們?cè)撔滦蜆?shù)突狀細(xì)胞亞群可能在炎癥狀態(tài)下發(fā)揮著更大的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　 由HESSCs誘導(dǎo)的這群新型調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)CTLA-4，而CTLA-4作為重要的負(fù)向調(diào)節(jié)分子，在抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此我們推測(cè)該新型樹(shù)突狀細(xì)胞亞群可能具有免疫抑制的功能

13、。通過(guò)體外混合淋巴反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)該新型DC亞群確實(shí)能夠顯著抑制maDC刺激后異體CD4+T細(xì)胞的增殖，具體的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。
　　 眾所周知，DC在未成熟狀態(tài)下具有極強(qiáng)的吞噬能力，當(dāng)其遇到刺激或吞噬抗原分化成熟后吞噬能力就基本喪失。而由成熟DC分化而來(lái)的該新型DC亞群的吞噬能力卻又大大增強(qiáng)，這一現(xiàn)象為我們對(duì)其功能的深入研究探討提供了極大的想象空間。
　　 總之通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)脾臟基質(zhì)細(xì)胞系HESSCs可以誘

14、導(dǎo)外周血單核細(xì)胞來(lái)源的maDC分化為一種高分泌PGE2、TGF-β等調(diào)節(jié)性因子的具有獨(dú)特表型CD11bhiCTLA-4+的新型人調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞亞群。我們初步將其命名為CD11bhiCTLA-4+DCreg。
　　 三、人體內(nèi)新型調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的鑒定
　　 在本部分研究工作中，我們著重在人體脾臟內(nèi)尋找并初步驗(yàn)證了這類(lèi)新型調(diào)節(jié)性樹(shù)突狀細(xì)胞的存在。
　　 為了驗(yàn)證該新型DC亞群是否真的存在于體內(nèi)，我們?cè)谌似⑴K中

15、尋找該DC亞群。我們首先用該新型DC亞群的特異性表面標(biāo)志(CD11c+CD11bhiCTLA-4+)將表型相同的細(xì)胞分選出來(lái)，再通過(guò)檢測(cè)它的細(xì)胞因子分泌情況及其抑制功能來(lái)判斷人體內(nèi)是否存在這樣一群還未被人們發(fā)現(xiàn)的DC亞群。
　　 我們用流式分選儀將人體脾臟內(nèi)CD11c+細(xì)胞分選為CD11chiHLA-DRhiCD11blow、CD11chiHLA-DRhiCD11bhi和CD11cintHLA-DRlowCD11bhi三個(gè)細(xì)胞亞

16、群來(lái)研究，經(jīng)過(guò)對(duì)細(xì)胞表型、混合淋巴反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌及吞噬能力多個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，證實(shí)人體脾臟內(nèi)存在一群CD11chiHLA-DRhiCD11bhi的細(xì)胞表達(dá)CTLA-4，且分泌大量的PGE2、TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子，具有較強(qiáng)的吞噬能力，在所占比例較大的情況下可以有效抑制體外maDC誘導(dǎo)的異體CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖。因此我們初步判斷人脾臟內(nèi)CD11chiHLA-DRhiCD11bhi細(xì)胞與體外脾臟基質(zhì)細(xì)胞系HESSCs誘導(dǎo)

17、分化的CD11bhiCTLA-4+DCreg具有相似的特點(diǎn)與功能。
　　 綜上所述，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人脾臟基質(zhì)細(xì)胞系HESSCs可以誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞來(lái)源的成熟DC分化為一群具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用的新型人樹(shù)突狀細(xì)胞亞群。該細(xì)胞亞群具有獨(dú)特的細(xì)胞表型CD11bhiCTLA-4+，高分泌PGE2、TGF-β等負(fù)向調(diào)節(jié)性因子，能夠有效抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖，并初步驗(yàn)證了其在人體(脾臟)內(nèi)的存在。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了對(duì)免疫微環(huán)境負(fù)