TNF-α相關(guān)炎癥介導(dǎo)的肺腺癌中樹(shù)突狀細(xì)胞免疫抑制功能的研究.pdf

1、目的：肺癌是當(dāng)今死亡率最高的惡性腫瘤之一，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)肺組織慢性炎癥反應(yīng)與肺癌發(fā)生密切相關(guān)。在癌變開(kāi)始階段，慢性炎癥反應(yīng)促進(jìn)肺免疫抑制微環(huán)境形成，即形成腫瘤相關(guān)炎癥微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在腫瘤形成前期，它主要由骨髓衍生抑制細(xì)胞（MDSC），調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg），腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM），以及其分泌的細(xì)胞因子和趨化因子組成，抑制效應(yīng) T細(xì)胞的功能，使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視功能，在腫瘤啟動(dòng)階段促進(jìn)肺癌發(fā)生；而在腫瘤形成后它還包括

2、腫瘤細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫抑制作用，抑制抗腫瘤免疫，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。
　　近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道，許多惡性腫瘤（例如乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、腎癌、頭頸癌、膀胱癌、胃癌和卵巢癌）相關(guān)微環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關(guān)樹(shù)突狀細(xì)胞（TADC）。與傳統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）識(shí)別、遞呈抗原，通過(guò)抗原遞呈作用激活效應(yīng)性CD4+T和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞不同，TADC激活后不誘導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞活化，而是促進(jìn)具有負(fù)向免疫調(diào)控作用的Treg分化

3、和擴(kuò)增，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。其在細(xì)胞功能以及分子表型上與目前報(bào)道的具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性 DC（DCreg）非常相似，如：上調(diào)CD11b，精氨酸酶I（arginase I），IDO，NO表達(dá)，改變MHC-Ⅱ，CD86， CD80和CD11c等表型分子表達(dá)；同時(shí)分泌炎癥抑制因子如TGF-β，IL-10和PGE-2等。目前對(duì)于TADC的研究多集中在腫瘤形成后，腫瘤細(xì)胞通過(guò)怎樣機(jī)制誘導(dǎo) TADC分化、浸潤(rùn)，而腫瘤相關(guān)慢性炎癥反應(yīng)是否誘導(dǎo)D

4、C發(fā)揮免疫抑制作用還不清楚。
　　目前關(guān)于腫瘤相關(guān)炎癥介導(dǎo)肺癌發(fā)生的研究證實(shí)：慢性炎癥反應(yīng)可以促進(jìn)MDSC和Treg分化和增值，進(jìn)而誘導(dǎo)肺免疫抑制微環(huán)境形成，促進(jìn)肺癌的發(fā)生。這一系列研究多采用麻醉藥烏拉坦誘導(dǎo)的細(xì)胞因子 TNF-α依賴的炎癥介導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生模型，抑制 TNF-α依賴炎癥反應(yīng)可以減少M(fèi)DSC和Treg浸潤(rùn)，進(jìn)而減少肺腺癌發(fā)生。因此本研究首先建立烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺腺癌發(fā)生模型，觀察腫瘤相關(guān) DC（TADC）的浸潤(rùn)和表型

5、改變情況，同時(shí)給予TNF-α中和抗體sTNFR：Fc抑制炎癥介導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生，探討抑制炎癥反應(yīng)對(duì)TADC表型和功能的影響，評(píng)估TADC與Treg浸潤(rùn)的相關(guān)性。為進(jìn)一步揭示慢性炎癥是否誘導(dǎo)DC發(fā)揮免疫抑制作用，本實(shí)驗(yàn)在烏拉坦誘導(dǎo)肺組織炎癥期（腫瘤形成前期），給予 sTNFR：Fc抑制 TNF-α依賴的炎癥反應(yīng)，探討對(duì)肺組織 DC浸潤(rùn)、表型以及功能改變的影響。
　　本研究旨在探討介導(dǎo)肺腺癌發(fā)生的TNF-α依賴的慢性炎癥反應(yīng)是否會(huì)誘導(dǎo)肺

6、組織DC發(fā)揮免疫抑制功能，進(jìn)一步揭示DC在炎癥介導(dǎo)的肺腫瘤免疫抑制微環(huán)境中的作用和機(jī)制。
　　方法:Balb/c小鼠腹腔注射烏拉坦每周一次，作為烏拉坦誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生組；對(duì)照組小鼠給予PBS溶液腹腔注射每周一次。連續(xù)給予8周后停止處理，繼續(xù)飼養(yǎng)至半年后，建立烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺腺癌發(fā)生模型。小鼠處死后取肺組織標(biāo)本，觀察腫瘤結(jié)節(jié)形成情況，組織學(xué)切片觀察肺腺癌形成情況；免疫組化方法觀察 Treg細(xì)胞浸潤(rùn)情況；FCM方法檢測(cè) TADC和Tr

7、eg細(xì)胞浸潤(rùn)情況；FCM方法檢測(cè)TADC表型分子CD11c，CD11b，MHC-Ⅱ，CD80，CD86，CD274等表達(dá)情況。
　　Balb/c小鼠腹腔注射烏拉坦每周一次，同時(shí)給予 PBS溶液腹腔注射每周兩次，作為烏拉坦誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生組；每周一次小鼠腹腔注射烏拉坦，同時(shí)給予每周兩次TNF-α中和抗體sTNFR：Fc，作為阻斷劑組；對(duì)照組小鼠給予PBS溶液腹腔注射每周三次。連續(xù)給予8周后停止處理，小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至半年后處死。計(jì)數(shù)小鼠

8、肺組織表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、組織學(xué)切片觀察肺腺癌形成情況，評(píng)估TNF-α中和抗體sTNFR：Fc對(duì)于肺腺癌形成的抑制作用；免疫組化方法觀察Treg細(xì)胞浸潤(rùn)情況；FCM方法檢測(cè)TADC和 Treg細(xì)胞浸潤(rùn)情況；FCM方法檢測(cè) TADC表型分子 CD11c， CD11b，MHC-Ⅱ，CD80，CD86，CD274等表達(dá)情況。體外分離純化肺組織DC與體外分離純化脾組織CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)DC對(duì)Treg的誘導(dǎo)作用。
　

9、　Balb/c小鼠腹腔注射烏拉坦每周一次，同時(shí)給予 PBS溶液腹腔注射每周兩次，作為烏拉坦誘導(dǎo)的肺炎癥組；每周一次小鼠腹腔注射烏拉坦，同時(shí)給予每周兩次TNF-α中和抗體sTNFR：Fc，作為阻斷劑組；對(duì)照組小鼠給予PBS溶液腹腔注射每周三次。連續(xù)給予8周后處死小鼠。在烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺組織炎癥期（腫瘤形成前期），檢測(cè)肺組織中 TNF-α， p-NF-κB，COX-2以及Treg細(xì)胞標(biāo)記物FOXP3的表達(dá)，評(píng)估抑制TNF-α對(duì)肺組織炎癥反應(yīng)

10、的影響。并觀察肺組織DC的浸潤(rùn)、表型改變以及功能變化，分析與Treg浸潤(rùn)的相關(guān)性，進(jìn)一步探討導(dǎo)致肺腺癌發(fā)生的TNF-α依賴的肺慢性炎癥反應(yīng)對(duì)DC免疫抑制作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1.烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)肺腺癌中腫瘤相關(guān)DC（TADC）的浸潤(rùn)和表型改變情況
　　1.1烏拉坦誘導(dǎo)炎癥相關(guān)肺腺癌形成免疫抑制微環(huán)境:與對(duì)照組相比，給予烏拉坦腹腔注射組小鼠均出現(xiàn)肺腺癌，同時(shí)伴隨Treg細(xì)胞標(biāo)志性分子Foxp3的高表達(dá)，提示T

11、reg細(xì)胞浸潤(rùn)增加，誘導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境的形成。
　　1.2烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)肺腺癌組織中TADC的浸潤(rùn)和表型分子的表達(dá):采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)，檢測(cè)小鼠肺臟組織中 DCs浸潤(rùn)情況。與對(duì)照組相比，烏拉坦誘導(dǎo)肺腺癌組CD11c+B200-細(xì)胞以及CD11c+CD11b+細(xì)胞浸潤(rùn)比例及細(xì)胞數(shù)均顯著增加，同時(shí)伴有表型分子 MHC-Ⅱ，CD11b和PD-L1表達(dá)增加。提示，免疫抑制微環(huán)境的形成可以誘導(dǎo)幼稚樹(shù)突狀細(xì)胞表型分子表達(dá)改變，可能發(fā)揮免

12、疫抑制作用。
　　1.3 TADC細(xì)胞因子分泌水平改變:采用Real-time PCR檢測(cè)IL-1，IL-6，IL-10，IL-12，TNF-α，COX-2的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，烏拉坦誘導(dǎo)肺腺癌組 TADC中IL-6，IL-10，COX-2細(xì)胞因子表達(dá)明顯升高，而TNF-α表達(dá)減少。提示，烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥相關(guān)肺腺癌中TADC細(xì)胞因子分泌能力發(fā)生改變，與細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用密切相關(guān)。
　　2.抑制 TNF-α依

13、賴炎癥反應(yīng)對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生以及 TADC浸潤(rùn)和表型分子表達(dá)的影響
　　2.1給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生的影響:給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc明顯抑制烏拉坦誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生，肺表面腫瘤團(tuán)塊減少。HE形態(tài)學(xué)觀察TNF-α阻斷劑組低倍視野內(nèi)腫瘤團(tuán)塊數(shù)量明顯減少。提示 TNF-α介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)在烏拉坦誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用。
　　2.2抑制TNF-α介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)對(duì)肺腺癌組織

14、中TADC以及Treg浸潤(rùn)的影響:與烏拉坦誘導(dǎo)肺腺癌組比較， TNF-α阻斷劑組肺腺癌組織CD11c+B200-細(xì)胞、CD11c+CD274+細(xì)胞以及CD11c+CD11b+細(xì)胞浸潤(rùn)比例及細(xì)胞數(shù)均有明顯降低。采用FCM方法檢測(cè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞浸潤(rùn)，發(fā)現(xiàn) TNF-α阻斷劑明顯抑制肺腺癌組織中 Treg細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)果提示：TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc抑制烏拉坦誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生，肺腺癌中TADC和Treg的浸潤(rùn)減少。

15、　　2.3抑制TNF-α介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)對(duì)肺腺癌組織中TADC表型分子表達(dá)的影響:與烏拉坦誘導(dǎo)肺腺癌組比較，TNF-α阻斷劑組肺腺癌組織 TADC表型分子CD80增加，而MHC-Ⅱ，CD11b和PD-L1表達(dá)下降；提示TNF-α相關(guān)炎癥與肺腺癌中TADC表型改變密切相關(guān)。
　　3.抑制TNF-α介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)對(duì)肺腺癌組織TADC誘導(dǎo)Treg擴(kuò)增的影響:采用DC對(duì)Treg的誘導(dǎo)作用評(píng)估DC的免疫抑制功能。分別分離烏拉坦組肺腺癌

16、和TNF-α阻斷劑組肺腺癌組織TADC與脾CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織TADC明顯促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞擴(kuò)增；而給予阻斷劑抑制肺腺癌發(fā)生，其TADC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增的能力減弱。提示慢性炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的肺腺癌中，TNF-α依賴的慢性炎癥與 TADC發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用密切相關(guān)。
　　4.導(dǎo)致肺腺癌發(fā)生的TNF-α依賴肺慢性炎癥反應(yīng)對(duì)DC免疫抑制作用的影響:為進(jìn)一步揭示是否肺組織慢性炎癥誘導(dǎo)DC發(fā)揮免疫抑制作

17、用，本實(shí)驗(yàn)在烏拉坦誘導(dǎo)肺組織炎癥期（腫瘤形成前期），給予 TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc抑制TNF-α依賴的炎癥反應(yīng)，觀察DC浸潤(rùn)、表型以及功能改變情況。
　　4.1抑制TNF-α對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響:形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)烏拉坦明顯促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞 TNF-α，p-NF-κB， COX-2蛋白表達(dá)，提示給予烏拉坦處理8周可以誘導(dǎo)小鼠肺組織炎癥反應(yīng)；與烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥期肺組織相比，TNF-α阻斷劑組小鼠肺泡上皮細(xì)胞 TN

18、F-α，p-NF-κB，COX-2蛋白表達(dá)明顯減少，提示，TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc可減輕烏拉坦誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)。
　　4.2抑制TNF-α對(duì)烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥期肺組織中Treg浸潤(rùn)的影響:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)烏拉坦明顯促進(jìn)小鼠肺組織 CD4+CD25+Treg細(xì)胞浸潤(rùn)；而與烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥期肺組織比較，給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc明顯抑制烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境中CD4+CD25+Treg細(xì)胞浸潤(rùn)。提示TNF-α依賴

19、的肺炎癥反應(yīng)促進(jìn)免疫抑制微環(huán)境的形成。
　　4.3 TNF-α依賴肺組織炎癥反應(yīng)中DCs浸潤(rùn)和表型分子表達(dá)情況:烏拉坦誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)中，DC細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加，表型分子MHC-Ⅱ，CD11b和PD-L1表達(dá)增加，CD80表達(dá)下降。給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc明顯抑制烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥微環(huán)境中DC浸潤(rùn)與表型改變。提示 TNF-α依賴的肺炎癥反應(yīng)促進(jìn) DC細(xì)胞浸潤(rùn)，可能發(fā)揮免疫抑制功能。
　　4.4 TNF-α依賴肺組

20、織炎癥反應(yīng)中DC對(duì)Treg擴(kuò)增的影響:分別分離烏拉坦誘導(dǎo)的炎癥期肺組織中和 TNF-α阻斷劑組中 DC與脾 CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示烏拉坦誘導(dǎo)炎癥肺組織 DC明顯促進(jìn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞擴(kuò)增；而給予阻斷劑抑制炎癥反應(yīng)，肺組織DC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增的能力減弱。提示TNF-α依賴的慢性炎癥反應(yīng)在肺腺癌發(fā)生前期，即可誘導(dǎo)DC發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用，誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg細(xì)胞擴(kuò)增。
　　結(jié)論：
　　1.烏拉坦

21、誘導(dǎo)的肺腺癌組織中，Treg浸潤(rùn)增加，形成腫瘤相關(guān)炎癥免疫抑制微環(huán)境，其中腫瘤相關(guān)DC浸潤(rùn)增加，TADC表型分子及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)生改變，可能發(fā)揮免疫抑制作用。
　　2.給予TNF-α阻斷劑sTNFR：Fc降低了烏拉坦誘導(dǎo)的肺腺癌發(fā)生，減少肺腺癌組織中TADC和Treg的浸潤(rùn)，逆轉(zhuǎn)了TADCs表型的改變， TADC誘導(dǎo)Treg細(xì)胞擴(kuò)增的能力減弱。提示TNF-α依賴的慢性炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)肺腺癌發(fā)生時(shí)，TADC發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控作用，TN