千里光肝臟毒性研究.pdf

1、千里光屬植物Seneciospp.在世界各地分布廣泛，全球約有1500多種，我國(guó)約有160余種，其中藥用品種38種。本研究采用千里光總生物堿、千里光單味藥提取物、千柏鼻炎片進(jìn)行平行比較，結(jié)合化學(xué)研究和PAs含量測(cè)定，從急性毒性、蓄積毒性、遺傳毒性等方面，研究了三者之間的差別，以期揭示千里光的毒性作用及其特點(diǎn)，生物堿含量與毒性之間的量-毒關(guān)系、毒-效關(guān)系以及復(fù)方配伍減毒作用等，為千里光的安全合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。檢測(cè)千里光致大鼠肝細(xì)胞DN

2、A損傷的方法。選用四種PAs單體化合物IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrotsine對(duì)HepG2細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，探討GSH對(duì)于肝細(xì)胞的保護(hù)作用，并采用免疫熒光和WESTERN-BLOT等方法，考察細(xì)胞小分子蛋白與PAs的毒性關(guān)系，不僅對(duì)千里光的全面深入了解發(fā)揮一些作用，而且對(duì)于含PAs的其他種屬植物的毒性的預(yù)防和治療，提供參考。
　　 本論文進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究

3、：
　　 1.急性毒性研究1.1不同產(chǎn)地千里光的總生物堿含量及其急性毒性比較研究為了搞清楚我國(guó)主要產(chǎn)區(qū)千里光的PAs含量和比較它們的毒性差異，為臨床和生產(chǎn)中選擇安全性高的藥材提供科學(xué)依據(jù)。比較了全國(guó)主要的代表性產(chǎn)區(qū)采集的千里光PAs含量和急性毒性。
　　 結(jié)果顯示不同產(chǎn)地的千里光毒性有很大的差別，其毒性強(qiáng)弱與千里光總生物堿含量有一定關(guān)系。其中，河南產(chǎn)千里光的生物堿含量最高，毒性也最強(qiáng)，而江蘇、浙江千里光也有一定的毒性，可

4、造成少量動(dòng)物死亡，但是二者的毒性較河南產(chǎn)千里光的毒性明顯減弱，其PAs含量也相對(duì)較低。湖北和廣西產(chǎn)千里光的生物堿含量最低，其毒性也最小。河南產(chǎn)千里光死亡和存活動(dòng)物肝臟病理學(xué)檢查顯示具有明顯的肝臟毒性作用，主要發(fā)現(xiàn)肝臟中央靜脈擴(kuò)張淤血、局灶性肝竇輕度擴(kuò)張淤血、雙核細(xì)胞和輕度鈣化灶。結(jié)果提示，在臨床用藥和含千里光的中成藥生產(chǎn)中，應(yīng)該注意產(chǎn)地選擇，選擇PAs含量低，毒性小的千里光入藥，以保證安全性。
　　 1.2千里光及其復(fù)方制劑經(jīng)口

5、用藥急性毒性研究本研究選擇毒性最大的河南千里光，進(jìn)行了成年小鼠、大鼠以及幼年小鼠的LD50測(cè)定，以分析其急性用藥的量-毒關(guān)系，在其安全劑量范圍內(nèi)用藥，可以保證用藥安全，為臨床用藥提供參考。
　　 結(jié)果顯示成年小鼠、幼年小鼠和大鼠一次性灌胃給予千里光水提物，在劑量過(guò)高時(shí)均顯示出有明顯的毒性和致死性，并有明顯的量-毒關(guān)系。對(duì)小鼠與大鼠的量-毒關(guān)系比較，可見(jiàn)大鼠對(duì)千里光的耐受較小鼠更強(qiáng)，表明千里光的毒性有一定的種屬差異。成年小鼠一次性

6、灌胃給予千柏鼻炎片水提物（含河南千里光），在劑量過(guò)高時(shí)顯示出有明顯的毒性和致死性，并有明顯的量-毒關(guān)系，千柏鼻炎片的毒性略低于千里光提取物毒性。
　　 2.千里光及其復(fù)方制劑長(zhǎng)期用藥的肝臟毒性研究采用毒性最強(qiáng)的河南產(chǎn)千里光的水提物、千柏鼻炎片及總生物堿部分，以20.0、6.0、3.0、1.5g生藥/kg四個(gè)劑量水平（相當(dāng)于臨床劑量的100、30、15、7.5倍）給大鼠連續(xù)灌胃給藥4w，觀察對(duì)肝臟的毒性。結(jié)果顯示千里光水提物、總生

7、物堿提取物、千柏鼻炎片分別結(jié)果表明，受試物的20.0g生藥/kg劑量組對(duì)凝血指標(biāo)APTT有一定縮短作用，千里光無(wú)論是單味藥、總生物堿提取部分還是復(fù)方，對(duì)肝臟生化指標(biāo)AST均有一定的影響。組織病理學(xué)顯示三種受試物的20.0g生藥/kg劑量組對(duì)大鼠肝臟有輕度毒性反應(yīng)。
　　 3.千里光致毒機(jī)理研究3.1千里光致大鼠肝臟細(xì)胞DNA損傷的研究采用反復(fù)灌胃給藥4w的千里光水提取物大鼠肝臟，利用彗星試驗(yàn)檢測(cè)千里光提取物對(duì)大鼠肝細(xì)胞DNA損傷

8、的遺傳終點(diǎn)即DNA斷裂。
　　 結(jié)果顯示千里光3個(gè)劑量均能使肝細(xì)胞脫尾率及DNA遷移率與對(duì)照組相比顯著提高，且肝細(xì)胞拖尾率與劑量存在相關(guān)性，說(shuō)明連續(xù)灌胃30天給予大鼠河南產(chǎn)的千里光能夠?qū)е麓笫蟾渭?xì)胞DNA斷裂，造成DNA損傷，損傷的頻率隨劑量的增加而增大，故該種千里光可導(dǎo)致肝細(xì)胞DNA發(fā)生損傷及影響肝功能。
　　 3.2千里光體內(nèi)致突變作用研究本實(shí)驗(yàn)采用反復(fù)灌胃給藥4w的大鼠股骨骨髓涂片，進(jìn)行骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)，以確定千里

9、光、千柏鼻炎片和總生物堿致突變作用。結(jié)果顯示三種受試物20.0g生藥/kg劑量下均能顯著升高大鼠骨髓細(xì)胞微核率，與對(duì)照組比較有非常顯著差異（P<0.05或P<0.01）。結(jié)果表明千里光、千柏鼻炎片和總生物堿具有一定的升高骨髓細(xì)胞微核率的作用，但是作用較弱。
　　 3.3PAs對(duì)HepG2肝細(xì)胞毒性研究運(yùn)用HepG2細(xì)胞作模型，研究IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retror

10、sine四種PAs單體化合物的細(xì)胞毒性，考察致毒過(guò)程中生化指標(biāo)的變化及對(duì)肝細(xì)胞DNA損傷的影響，預(yù)測(cè)含HPAs植物藥的毒性。
　　 結(jié)果顯示：選用的四種PAs單體化合物IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine在各自的高濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞皆有高抑制率，明顯抑制細(xì)胞活性，Monocrataline、Retrorsine的細(xì)胞毒性較強(qiáng)。對(duì)生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞受損傷時(shí)

11、，細(xì)胞內(nèi)的生物活性酶就會(huì)大量釋放到上清中，IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocra.taline、Retrorsine能夠明顯影響肝細(xì)胞的CK、LDH生物活性酶，增加這兩種活性酶的釋放率；Monocrataline和Retrotsine細(xì)胞毒性相對(duì)較強(qiáng)，Monocrataline和Retrorsine的適當(dāng)濃度能夠使肝細(xì)胞AST、ALT的釋放率增加。說(shuō)明Monocrataline、Retrorsine比

12、IntegerrimineA、B對(duì)肝細(xì)胞損傷程度高，對(duì)HepG2細(xì)胞毒性更強(qiáng)。
　　 單細(xì)胞凝膠電泳結(jié)果表明四種PAs單體化合物可引起DNA遷移的變化，拖尾細(xì)胞率明顯高于正常細(xì)胞。導(dǎo)致DNA段裂，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡。
　　 3.4谷胱甘肽對(duì)PAs毒性的影響通過(guò)檢測(cè)PAs致HEPG2細(xì)胞毒性GSH的含量變化，研究PAs致毒與GSH相關(guān)性，選用細(xì)胞活性抑制率和PAs肝細(xì)胞毒性顯著性指標(biāo)ALT，通過(guò)生物合成抑制劑丁胱亞磺酰亞胺

13、（BSO）及合成GSH的前提物質(zhì)N-乙酰半胱氨酸（NAC）的作用于HepG2細(xì)胞分別抑制和增加細(xì)胞內(nèi)GSH的含量，間接探討GSH在PAs所致肝細(xì)胞毒性過(guò)程中的作用。
　　 結(jié)果顯示：用HepG2細(xì)胞探討PAs致肝毒性GSH對(duì)其影響，發(fā)現(xiàn)PAs具有明顯的肝細(xì)胞毒性，GSH合成抑制劑.BSO可使PAs肝細(xì)胞毒性明顯增強(qiáng)，而GSH合成前體物半胱氨酸可使.PAs肝細(xì)胞毒性減弱，間接說(shuō)是GSH對(duì)PAs肝細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用。在肝細(xì)胞培養(yǎng)液

14、中加入GSH合成前體物半胱氨酸，肝細(xì)胞可攝取半胱氨酸并用來(lái)合成GSH，4h后，細(xì)胞內(nèi)GSH濃度可提高。在肝細(xì)胞培養(yǎng)基中加入GSH合成抑制劑BSO，肝細(xì)胞不能繼續(xù)合成GSH，原有的GSH經(jīng)過(guò)16h的逐漸消耗，肝細(xì)胞GSH濃度降低。BSO和半胱氨酸對(duì)肝細(xì)胞GSH濃度有完全相反的影響，對(duì)PAS肝細(xì)胞毒性也具有完全相反的作用，因此，可以認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)GSH與PAs肝細(xì)胞毒性相關(guān)。
　　 3.5PAs對(duì)HepG2細(xì)胞的小分子蛋白及細(xì)胞因子的影

15、響充分利用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫化學(xué)等手段深入研究IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine的細(xì)胞毒性，研究其對(duì)VEGF、GM130、Cav-1的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)肝臟的毒性機(jī)制。
　　 結(jié)果顯示：PAs致HepG2細(xì)胞毒后VEGF呈現(xiàn)高表達(dá)，且IntegerrimineA、Monocrataline、Retrorsine在致HEPG2細(xì)胞毒24h時(shí)，He

16、pG2表達(dá)VEGF呈高峰，IntegerrimineA、Monocmtaline、Retrorsine誘導(dǎo)VEGF具有時(shí)間依賴性。HepG2細(xì)胞分別經(jīng)四種不同PAs（IntegerrimineA、IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine）作用后經(jīng)免疫熒光標(biāo)記，四種吡咯里西啶生物堿均能降低HepG2胞漿內(nèi)GM130的含量，IntegerrimineB、Monocrataline、Retrorsine能