C-型利尿鈉肽對血管外膜慢性損傷大鼠頸埃及舒縮功能保護作用機制及藥物干預研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是一種多器官受累的常見血管疾病,高血壓、冠心病為其重要并發(fā)癥,成為日益威脅人類生命的主要死亡原因之一,其危害性已舉世公認。它是許多心血管疾病的病理基礎,主要累及大型及中型肌彈力型動脈,以主動脈、冠狀動脈及腦動脈為多見,常導致管腔閉塞或管壁破裂出血等嚴重后果,動脈硬化早期受累血管常伴有血管收縮性增強,并導致血管痙攣。動脈壁具有三層結構:內(nèi)膜、中膜、外膜。每一層均具有獨特的組織學、生物學及功能特征,并且每層以獨特的方式來維持血管

2、穩(wěn)定及調(diào)節(jié)血管對各種刺激及損傷的反應。近二十年來,有關血管內(nèi)膜對血管功能的影響進行了深入廣泛地研究,血管內(nèi)膜在調(diào)節(jié)血管平滑肌功能中的作用已得到普遍的認同。但是,越來越多的證據(jù)顯示外膜調(diào)節(jié)血管功能的作用遠大于其作為血管壁支撐結構的作用。近年來有關血管外膜在調(diào)節(jié)血管平滑肌舒縮功能中的作用方面的研究日益受到關注。1994年,Shimokawa等用IL-1β包裹豬冠狀動脈外膜介導冠脈病變的動物模型,證明在體情況下,血管外膜慢性炎癥刺激能導致血管

3、收縮反應性增高,提示血管外膜能調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮功能,參與血管張力的調(diào)節(jié);用硅膠管包裹兔頸動脈的動物模型已成為研究動脈粥樣硬化的經(jīng)典動物模型。此動物模型以硅膠管包裹血管導致血管外膜慢性損傷但不直接損傷血管中膜及內(nèi)膜,產(chǎn)生具有人動脈粥樣硬化早期特征的新生內(nèi)膜病損;除新生內(nèi)膜形成外,硅膠管包裹還能引起與早期人類動脈粥樣硬化病變相似的血管功能的變化:對5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的收縮血管活性高敏感。

4、>　　 C.型利尿利鈉肽(C-type natfiuretic peptide,CNP)作為鈉尿肽家族的新成員,其生理作用十分廣泛,但是目前關于CNP的臨床研究報道甚少,由于A-型利尿利鈉肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和B-型利尿利鈉肽(brain nalriuretic peptide,BNP)的臨床意義極受重視而且研究廣泛,故近年CNP在疾病中的應用研究逐漸增多,尤其發(fā)現(xiàn)CNP與血管損傷性疾病關

5、系密切。在心血管系統(tǒng)中CNP主要與B型利尿鈉肽受體(NPR-B)結合,激活顆粒型鳥苷酸環(huán)化酶(particulate guanylylcyclase,pGC)生成環(huán)磷鳥苷酸(Cyclic Guanosine Monophosphate,cGMP),環(huán)磷鳥苷酸依賴的蛋白激酶(cGMP-Dependent Protein Kinase G,PKG)I是cGMP的主要細胞內(nèi)受體,在cGMP介導的多種生理過程中發(fā)揮著核心作用,如調(diào)節(jié)血管平滑肌的

6、收縮和舒張,抗高血壓,抗心肌肥大,抗動脈粥樣硬化和抗血管損傷/再狹窄等。
　　 既往實驗雖然已經(jīng)證實硅膠管包裹大鼠頸動脈導致血管中膜持續(xù)性收縮及對5-HT收縮血管反應敏感性增加,但是機理不是十分清楚。
　　 目的：
　　 基于以上研究及理論基礎,本實驗復制了利用硅膠管包裹大鼠頸動脈制備血管外膜慢性損傷刺激導致血管收縮性增強的動物模型,觀察血管外膜慢性損傷對血管收縮功能的影響以及血清及局部組織中CNP和其下游靶點c

7、GMP、PKG I的表達和變化;并且應用不同劑量的通心絡和經(jīng)典的調(diào)脂藥物阿托伐他汀進行干預,觀察傳統(tǒng)中醫(yī)絡病理論指導下研制的復方制劑通心絡超微粉劑慢性治療對該動物模型的影響,探討通心絡和他汀類藥物降低血管收縮反應性的機制:是否與增加了血清和血管組織中的CNP有關。
　　 方法：
　　 一、動物模型部分
　　 用硅膠管包裹大鼠頸動脈制備血管外膜慢性損傷介導血管收縮性增高的動物模型:12周的雄性SD大鼠,體重220-

8、250克。普通大鼠食料喂養(yǎng)1周后分成5組,每組12只,除空白對照組外,其它組腹腔內(nèi)注射10％水合氯醛0.3ml/100g麻醉大鼠,用內(nèi)徑1.5mm,長10mm的硅膠管縱向切開后包裹于右側頸動脈外,縫合傷口。實驗共分為5組:①正常組:普通飲食2周。②手術對照組(即模型組):普通飲食喂養(yǎng)1周,硅膠管包裹右側頸動脈1周,繼續(xù)普通飲食。③藥物干預組:本組包括一個阿托伐他汀組和兩個通心絡超微粉組:普通飲食+阿托伐他汀鈣片(5mg/kg/day)喂

9、養(yǎng)1周,硅膠管包裹右側頸動脈1周,繼續(xù)給予普通飲食+阿托伐他汀鈣片(5mg/kg/day)喂養(yǎng);普通飲食+兩個不同劑量的通心絡超微粉(300mg/kg/day,600mg/kg/day)喂養(yǎng)1周,硅膠管包裹右側頸動脈1周,繼續(xù)給予普通飲食+不同劑量的通心絡。于包管術后1周,用超聲外周血管血流量測定儀測量大鼠雙側頸動脈血流量,并觀察血管對局部應用5-HT的反應;并且取雙側頸動脈標本,HE染色,光鏡下觀察血管外膜慢性損傷對血管形態(tài)學的影響;

10、運用elisa的方法測定各組血清中的CNP含量、血管組織中cGMP含量:運用蛋白印記的方法測定血管組織中CNP、PKGⅠα、PKGⅠβ的表達。
　　 二、細胞培養(yǎng)部分
　　 體外大鼠主動脈平滑肌細胞,利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的方法測定在不同的濃度(10-5M～10-9M)、在不同時間點(0,5,10,15,20,30分鐘)下CNP刺激平滑肌細胞生成的cGMP的含量,選取合適的CNP濃度和時間點進行下一步實驗;利用

11、Westen-blot的方法測定在不同時間點(0,5,10,15,20,30分鐘)下,CNP刺激平滑肌細胞生成的PKGⅠα和PKGⅠβ的情況:利用共聚焦顯微鏡技術體外觀察5-HI、對于主動脈平滑肌細胞的收縮反應,并且觀察CNP在體外是否對5-羥色胺的收縮反應有拮抗作用及其可能的機制。
　　 結果：
　　 一、動物模型部分
　　 各組大鼠右頸動脈經(jīng)HE染色后普通光鏡下進行觀察比較發(fā)現(xiàn),手術對照組出現(xiàn)明顯的病理改變:

12、血管包裹1周后血管口徑明顯變小,內(nèi)彈力板極度彎曲,中膜明顯增厚,外膜輕度增生,少量的炎細胞浸潤:同手術對照組相比,各個藥物干預組應用2周均能明顯改善外膜慢性炎癥損傷部位的頸動脈形態(tài)學改變。
　　 硅膠管包裹一周后,手術對照組右側頸動脈基礎血流量(2.60±0.21ml/min)較正常組右頸動脈明顯降低(3.49±0.11ml/min,p＜0.01),并且手術對照組右頸動脈對血管局部應用5-HT的收縮反應性明顯增強,局部滴注5-H

13、T后血流量變化率(38.22±3.10％)明顯高于正常組右頸動脈(16.35±0.76％,p＜0.01);與正常組相比,各個藥物干預組的右頸動脈基礎血流量及局部滴注5-HT后血流量變化率無明顯差異(p＞0.05);但同手術對照組相比,各個藥物干預組對右頸動脈血流量及局部滴注5-HT后血流量變化率差異明顯(p＜0.01),同時發(fā)現(xiàn)低劑量通心絡組的血流變化率同阿托伐他汀組相似(p=0.625),而高劑量通心絡組的血流變化率同阿托伐他汀相比有

14、所減少,有統(tǒng)計學差異(p=0.016)。
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動脈一周后,運用elisa的方法測定各組血清中的CNP含量,結果發(fā)現(xiàn):雖然手術對照組大鼠血清中CNP的含量較正常組有所降低,同時各個藥物干預組同手術對照組相比,血清中CNP的含量均有增高趨勢,但是組間比較無統(tǒng)計學差異(p=0.089)。
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動脈一周后,運用elisa的方法測定各組血管組織中的cGMP含量,結果發(fā)現(xiàn):對照組右頸動脈同正常

15、組相比,血管組織中的cGMP表達下降且有顯著的統(tǒng)計學差異(p＜0.01);而通心絡各個劑量組和阿托伐他汀組右頸動脈血管組織中的cGMP含量同對照組右頸動脈相比明顯增高有統(tǒng)計學差異,同時發(fā)現(xiàn)兩個通心絡組右頸動脈血管組織中cGMP含量同阿托伐他汀組相比仍有增高且有極顯著的統(tǒng)計學差異(p=0.000)
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動脈一周后,運用Westen-blot方法測定各組右頸動脈組織中CNP的表達,結果發(fā)現(xiàn):正常組血管組織中有CN

16、P表達,手術對照組右頸動脈血管組織中的CNP表達較正常組減少約30％,且有統(tǒng)計學差異(p=0.016),而各個藥物干預組右頸動脈血管組織中的CNP均有增高趨勢,且有統(tǒng)計學差異(0＜0.05),同時發(fā)現(xiàn)右頸動脈血管組織中CNP的表達,低劑量通心絡組同阿托伐他汀組相比無統(tǒng)計學差異(p=0.225),而高劑量通心絡組同阿托伐他汀組相比有統(tǒng)計學差異(p=0.010)。
　　 硅膠管包裹大鼠右頸動脈一周后,運用Westen-blot方法測

17、定各組右頸動脈組織中PKG I的表達,結果發(fā)現(xiàn):1、正常組血管組織中有PKGⅠα的表達,手術對照組右頸動脈血管組織中的PKGⅠα表達較正常組減少有統(tǒng)計學差異(p＜0.05),而各個藥物干預組血管組織中的PKGⅠα表達較手術對照組均明顯增高,有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。同時發(fā)現(xiàn)血管組織中PKG Iα的表達,低劑量通心絡組同阿托伐他汀組相比無統(tǒng)計學差異(p=0.310),而高劑量通心絡組同阿托伐他汀組相比有極顯著的統(tǒng)計學差異(p=0.00

18、0);2、運用Westen-blot方法測定血管組織中PKGⅠβ的表達,結果發(fā)現(xiàn):各組血管組織中均有PKGⅠβ的表達,雖然對照組PKGⅠβ的表達較其它組有下降趨勢,但組間比較無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　 二、細胞培養(yǎng)部分
　　 運用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的方法,我們發(fā)現(xiàn):在不同濃度(10-5M～10-9M)時,CNP刺激大鼠主動脈平滑肌細胞生成cGMP量均在10分鐘左右出現(xiàn)一個高峰,故細胞培養(yǎng)部分均采用中間

19、濃度(10-7M的CNP)和10分鐘這個時間點。
　　 運用Westen-blot方法測定給予10-7M的CNP刺激后,大鼠主動脈平滑肌細胞在不同時間點(0,5,10,15,20,30分鐘)生成的PKG I情況,結果發(fā)現(xiàn):1、正常的大鼠主動脈平滑肌細胞中有少量的PKGⅠα的表達,加入CNP后各個時間點PKGⅠα的表達均明顯增加,有統(tǒng)計學差異(p＜0.05);2、同時我們也發(fā)現(xiàn),在正常的大鼠動脈平滑肌細胞中也有少量的PKGⅠβ的表

20、達,但是在加入CNP后在各個時間點上PKGⅠβ的表達沒有明顯變化,無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。
　　 運用共聚焦顯微鏡技術,我們發(fā)現(xiàn):①10-5M的5-HT后,細胞表面積(PCSA)明顯減小(大約減少34.04％±9.14％),有統(tǒng)計學差異(P＜0.05),表明5-HT在體外仍然有強烈的收縮平滑肌細胞的作用:②而在加入CNP(10-7M)之后再加入同樣濃度的5-HT,細胞表面積縮小程度明顯減輕,與加入5-HT之前相比沒有統(tǒng)計學

21、差異(p＞0.05),表明CNP在體外有拮抗5-HT的收縮平滑肌細胞的作用;⑨最后在加入CNP和PKG I的阻斷劑KT-5823(2宰10-6M)后再加入同樣濃度的5-HT,細胞表面積又再次明顯縮小(大約減少33.24％±10.62％),CNP的抗5-HT的收縮作用被KT-5823所逆轉(zhuǎn),表明CNP抵抗5-HT的收縮作用主要與PKGⅠα有關。
　　 結論：
　　 1、血管外膜慢性損傷早期階段可以引起血管慢性痙攣,血流量下

22、降,血管對5-HT的反應敏感性增加,局部血管組織中CNP的蛋白表達下調(diào)是血管外膜慢性損傷引起血管收縮反應性增強的重要機制之一;并且CNP的降低血管收縮反應性的作用同局部血管組織中PKGⅠα的表達密切相關,同局部血管組織中PKGⅠβ的表達關系不密切。
　　 2、應用通心絡超微粉和阿托伐他汀一樣均能預防和改善血管外膜慢性損傷所致的血管慢性痙攣及血管對5-HT的高反應性,這種作用主要通過上調(diào)局部血管組織中CNP的蛋白表達來發(fā)揮其緩解血