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文檔簡介
1、近年來,由于免疫抑制患者及致病性真菌耐藥菌株日益增多,深部真菌感染的發(fā)病率逐年上升,已成為目前困擾醫(yī)療工作的主要難題之一,這促使藥學工作者及臨床醫(yī)生不斷開發(fā)新的高效低毒的抗真菌藥物。化學合成一種新的抗真菌化合物需耗費大量人力物力。中藥對真菌感染的治療歷史悠久,積累了豐富經驗,利用現(xiàn)代工藝從中草藥中分離有效的抗真菌成分為開發(fā)新藥的便捷途徑。土槿乙酸(Pseudolaricacid B,PLAB)是從我國的松科植物金錢松(Pseudolar
2、ixKaempferi Gord)的根皮及近根皮分離出來的二萜類化合物,具有顯著的抗腫瘤活性,研究發(fā)現(xiàn)還具有較強的抗真菌活性,但對其抗真菌機制的研究還比較少。 目的:本文主要研究PLAB對白色念珠菌的抑制作用及特點,并初步探討其作用機制,以便為藥物開發(fā)及臨床應用提供堅實的理論依據(jù)。 方法: 1 白色念珠菌的生長曲線:測定白色念珠菌在自然條件下生長的細胞周期變化規(guī)律。在培養(yǎng)條件不變的情況下,定時取樣,采用OD值法
3、和活菌計數(shù)法計算細菌的數(shù)量變化,并繪制其生長曲線。 2 藥物敏感性實驗:應用液體稀釋法測定PLAB對白色念珠菌、新型隱球菌、絮狀表皮癬菌的最低抑菌濃度(MIC)。 3 光學顯微鏡觀察PLAB對白色念珠菌形態(tài)學的影響: PLAB對白色念珠菌血清芽管形成的影響;不染色及細胞壁染色檢查PLAB對白色念珠菌形態(tài)學的影響。 4 透射電子顯微鏡(Transmission E1ectron Microscope-
4、TEM)觀察PLAB對白色念珠菌的超微結構的影響。 5 流式細胞儀(F10w Cytometry-FCM)測定PLAB對白色念珠菌細胞周期的影響。 6 PLAB對白色念珠菌細胞膜甾醇生物合成的影響:通過高效液相色譜(HPLC)和氣質聯(lián)用(GC-MS)同時測定PLAB對白色念珠菌細胞膜組分麥角甾醇生物合成的影響。 結果: 1 從生長曲線可知白色念珠菌在最初生長的16~30小時處于對數(shù)生長期,之后進入穩(wěn)
5、定生長期及衰退期。 2 藥物敏感性實驗結果顯示PLAB對這三種標準菌株均具有較強的抗菌活性,其MIC值分別為64μg/ml、64μg/ml、32μg/ml。 3 通過光學顯微鏡觀察PLAB作用前后白色念珠菌形態(tài)變化可以發(fā)現(xiàn):土槿乙酸可抑制白色念珠菌芽管的產生并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(p<0.05)。不染色標本中可見經一定濃度的PLAB作用后,白色念珠菌由圓形變?yōu)榘魻睿蛹毎c母細胞不易分離而呈短鏈狀聚集生長。將標本經過
6、細胞壁染色法染色后,可見經藥物作用后的白色念珠菌細胞壁及細胞質均染成紫色,只是細胞質染色稍淺淡。但未經藥物作用的白色念珠菌只是外周細胞壁染成紫色。 4 應用TEM觀察發(fā)現(xiàn)未經藥物作用的白色念珠菌形態(tài)正常,呈圓形或橢圓形,細胞結構清晰完整,細胞壁、細胞膜光滑,層次清楚,細胞核明顯,可見出芽。經一定濃度的PLAB作用后,細胞變形,結構模糊,細胞壁疏松,有裂口,細胞膜連續(xù)性破壞,進而破碎成碎片互相融合。胞漿內容物漏出,胞核破碎,細胞
7、器腫脹,進而開始破損變形。細胞內成分不清,為大量空白區(qū)。且這種變化呈現(xiàn)劑量及作用時間的依賴性。 5 FCM測定PLAB對白色念珠菌細胞周期的影響:FCM細胞周期圖顯示與對照組相比,經過藥物處理后的白色念珠菌細胞G1期比例升高,S期比例降低,導致增值指數(shù)(PI%)降低,且藥物濃度越高,增值指數(shù)越低(p<0.05),說明PLAB可使細胞周期阻斷在S期。FCM直方圖圖形反映細胞DNA含量的熒光強度。峰值左移,反映DNA片段的丟失,本
8、試驗顯示隨著藥物濃度的升高,直方圖峰值越向左移動,即細胞核損傷越嚴重。FCM散點圖顯示,作用于細胞的藥物濃度越高,細胞受損越嚴重,即散點圖形越向左下移動。 6 應用HPLC測定PLAB對白色念珠菌細胞膜組分麥角甾醇合成的影響時發(fā)現(xiàn),經一定濃度的PLAB作用后白色念珠菌的細胞膜主分麥角甾醇的含量下降且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(p<0.05)。應用GC.MS測定PLAB對白色念珠菌細胞膜甾醇合成的影響時發(fā)現(xiàn)經一定濃度的PLAB作用后白
9、色念珠菌的細胞膜主分麥角甾醇的含量下降,同時角鯊烯的含量也有所降低。 結論: 1 體外實驗:PLAB能明顯抑制白色念珠菌、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌等多種真菌的生長,說明其在體外具有抗真菌作用。 2 PLAB的抗真菌機制與以下幾個方面有關: (1)據(jù)形態(tài)學推測,PLAB抑制了白色念珠菌細胞壁合成所需的β-1,3葡聚糖合成酶或幾丁質合成酶的活性,使細胞壁的合成受阻,細胞壁通透性增加,從而發(fā)揮抗真菌作用。
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