土槿乙酸（PLAB）的抗真菌機制.pdf

1、近年來，由于免疫抑制患者及致病性真菌耐藥菌株日益增多，深部真菌感染的發(fā)病率逐年上升，已成為目前困擾醫(yī)療工作的主要難題之一，這促使藥學(xué)工作者及臨床醫(yī)生不斷開發(fā)新的高效低毒的抗真菌藥物?；瘜W(xué)合成一種新的抗真菌化合物需耗費大量人力物力。中藥對真菌感染的治療歷史悠久，積累了豐富經(jīng)驗，利用現(xiàn)代工藝從中草藥中分離有效的抗真菌成分為開發(fā)新藥的便捷途徑。土槿乙酸(Pseudolaricacid B，PLAB)是從我國的松科植物金錢松(Pseudolar

2、ixKaempferi Gord)的根皮及近根皮分離出來的二萜類化合物，具有顯著的抗腫瘤活性，研究發(fā)現(xiàn)還具有較強的抗真菌活性，但對其抗真菌機制的研究還比較少。 目的：本文主要研究PLAB對白色念珠菌的抑制作用及特點，并初步探討其作用機制，以便為藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用提供堅實的理論依據(jù)。 方法： 1 白色念珠菌的生長曲線：測定白色念珠菌在自然條件下生長的細(xì)胞周期變化規(guī)律。在培養(yǎng)條件不變的情況下，定時取樣，采用OD值法

3、和活菌計數(shù)法計算細(xì)菌的數(shù)量變化，并繪制其生長曲線。 2 藥物敏感性實驗：應(yīng)用液體稀釋法測定PLAB對白色念珠菌、新型隱球菌、絮狀表皮癬菌的最低抑菌濃度(MIC)。 3 光學(xué)顯微鏡觀察PLAB對白色念珠菌形態(tài)學(xué)的影響： PLAB對白色念珠菌血清芽管形成的影響；不染色及細(xì)胞壁染色檢查PLAB對白色念珠菌形態(tài)學(xué)的影響。 4 透射電子顯微鏡(Transmission E1ectron Microscope-

4、TEM)觀察PLAB對白色念珠菌的超微結(jié)構(gòu)的影響。 5 流式細(xì)胞儀(F10w Cytometry-FCM)測定PLAB對白色念珠菌細(xì)胞周期的影響。 6 PLAB對白色念珠菌細(xì)胞膜甾醇生物合成的影響：通過高效液相色譜(HPLC)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)同時測定PLAB對白色念珠菌細(xì)胞膜組分麥角甾醇生物合成的影響。 結(jié)果： 1 從生長曲線可知白色念珠菌在最初生長的16～30小時處于對數(shù)生長期，之后進入穩(wěn)

5、定生長期及衰退期。 2 藥物敏感性實驗結(jié)果顯示PLAB對這三種標(biāo)準(zhǔn)菌株均具有較強的抗菌活性，其MIC值分別為64μg/ml、64μg/ml、32μg/ml。 3 通過光學(xué)顯微鏡觀察PLAB作用前后白色念珠菌形態(tài)變化可以發(fā)現(xiàn)：土槿乙酸可抑制白色念珠菌芽管的產(chǎn)生并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(p<0.05)。不染色標(biāo)本中可見經(jīng)一定濃度的PLAB作用后，白色念珠菌由圓形變?yōu)榘魻?，子?xì)胞與母細(xì)胞不易分離而呈短鏈狀聚集生長。將標(biāo)本經(jīng)過

6、細(xì)胞壁染色法染色后，可見經(jīng)藥物作用后的白色念珠菌細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)均染成紫色，只是細(xì)胞質(zhì)染色稍淺淡。但未經(jīng)藥物作用的白色念珠菌只是外周細(xì)胞壁染成紫色。 4 應(yīng)用TEM觀察發(fā)現(xiàn)未經(jīng)藥物作用的白色念珠菌形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜光滑，層次清楚，細(xì)胞核明顯，可見出芽。經(jīng)一定濃度的PLAB作用后，細(xì)胞變形，結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞壁疏松，有裂口，細(xì)胞膜連續(xù)性破壞，進而破碎成碎片互相融合。胞漿內(nèi)容物漏出，胞核破碎，細(xì)胞

7、器腫脹，進而開始破損變形。細(xì)胞內(nèi)成分不清，為大量空白區(qū)。且這種變化呈現(xiàn)劑量及作用時間的依賴性。 5 FCM測定PLAB對白色念珠菌細(xì)胞周期的影響：FCM細(xì)胞周期圖顯示與對照組相比，經(jīng)過藥物處理后的白色念珠菌細(xì)胞G1期比例升高，S期比例降低，導(dǎo)致增值指數(shù)(PI％)降低，且藥物濃度越高，增值指數(shù)越低(p<0.05)，說明PLAB可使細(xì)胞周期阻斷在S期。FCM直方圖圖形反映細(xì)胞DNA含量的熒光強度。峰值左移，反映DNA片段的丟失，本

8、試驗顯示隨著藥物濃度的升高，直方圖峰值越向左移動，即細(xì)胞核損傷越嚴(yán)重。FCM散點圖顯示，作用于細(xì)胞的藥物濃度越高，細(xì)胞受損越嚴(yán)重，即散點圖形越向左下移動。 6 應(yīng)用HPLC測定PLAB對白色念珠菌細(xì)胞膜組分麥角甾醇合成的影響時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)一定濃度的PLAB作用后白色念珠菌的細(xì)胞膜主分麥角甾醇的含量下降且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(p<0.05)。應(yīng)用GC.MS測定PLAB對白色念珠菌細(xì)胞膜甾醇合成的影響時發(fā)現(xiàn)經(jīng)一定濃度的PLAB作用后白

9、色念珠菌的細(xì)胞膜主分麥角甾醇的含量下降，同時角鯊烯的含量也有所降低。 結(jié)論： 1 體外實驗：PLAB能明顯抑制白色念珠菌、新生隱球菌、絮狀表皮癬菌等多種真菌的生長，說明其在體外具有抗真菌作用。 2 PLAB的抗真菌機制與以下幾個方面有關(guān)： (1)據(jù)形態(tài)學(xué)推測，PLAB抑制了白色念珠菌細(xì)胞壁合成所需的β-1，3葡聚糖合成酶或幾丁質(zhì)合成酶的活性，使細(xì)胞壁的合成受阻，細(xì)胞壁通透性增加，從而發(fā)揮抗真菌作用。