東亞飛蝗抵抗真菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制研究.pdf

1、宿主昆蟲在與病原微生物長期斗爭的過程中，進(jìn)化出來一系列與植物、動(dòng)物相似的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)來抵抗病原微生物的感染。昆蟲的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)主要包括：體壁的機(jī)械屏障作用、體液免疫和細(xì)胞免疫。昆蟲病原真菌是昆蟲重要的致病菌，病原真菌通過在宿主昆蟲體表附著和萌發(fā)啟動(dòng)侵染，病原真菌一旦穿透宿主昆蟲體壁，即可以快速播散形成感染。因此，病原真菌與宿主昆蟲之間的斗爭猶如“矛和盾”的關(guān)系，病原真菌侵染宿主昆蟲的結(jié)果轉(zhuǎn)歸主要由宿主昆蟲的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)和病原

2、真菌致病力之間的相互作用決定。詳細(xì)闡明宿主昆蟲抵抗真菌感染的固有免疫應(yīng)答機(jī)制對(duì)于尋找更加有效的殺蟲靶標(biāo)和開發(fā)更加高毒的工程真菌菌株以及設(shè)計(jì)害蟲防治策略具有極其重要的意義。
　　 以往研究多認(rèn)為宿主昆蟲的固有免疫應(yīng)答反應(yīng)發(fā)生在真菌侵染穿透宿主昆蟲體壁的皮細(xì)胞層(epidermis)時(shí)，而本研究的前期研究發(fā)現(xiàn)，在病原真菌綠僵菌侵染東亞飛蝗的早期(6-24小時(shí))，感病蝗蟲體內(nèi)出現(xiàn)大量基因發(fā)生表達(dá)變化，這就提示宿主昆蟲對(duì)病原真菌的固有免

3、疫反應(yīng)的起始時(shí)間可能比我們想象的更早。另外，脂肪體和血細(xì)胞是被普遍承認(rèn)的重要的固有免疫應(yīng)答器官，但近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道體壁、中腸等組織中也有免疫相關(guān)基因的表達(dá)，但究竟有哪些組織參與宿主昆蟲抵抗真菌感染目前尚無系統(tǒng)性研究。
　　 Toll信號(hào)通路是宿主昆蟲固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中重要的體液免疫信號(hào)途徑。Toll信號(hào)通路是存在于從低等的線蟲到高等的哺乳動(dòng)物中的一條保守信號(hào)通路，該通路在昆蟲體內(nèi)可同時(shí)參與抵抗真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的感染。另外，

4、酚氧化酶系統(tǒng)是宿主昆蟲固有免疫應(yīng)答反應(yīng)中重要的細(xì)胞免疫途徑。β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白(βGRP)是酚氧化酶系統(tǒng)上游主要識(shí)別真菌細(xì)胞壁成分β-1，3-葡聚糖的重要受體，βGRP對(duì)于β-1，3-葡聚糖的識(shí)別可以引起下游的酚氧化酶系統(tǒng)活化，進(jìn)而調(diào)控昆蟲血細(xì)胞參與包裹和黑化病原微生物。對(duì)按蚊的研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾沉默βgrp基因后可以使得酚氧化酶信號(hào)通路激活障礙，進(jìn)而抑制血細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的黑化包裹作用，并導(dǎo)致按蚊的存活率降低；但是，對(duì)果蠅的研

5、究卻發(fā)現(xiàn)，將酚氧化酶信號(hào)通路中的酚氧化酶激活酶沉默后使得酚氧化酶激活障礙后，突變的果蠅仍和野生型果蠅一樣能夠抵抗真菌的感染，這就說明在果蠅中βGRP也可能并不參與抵抗真菌。由此可見，βgrp卻基因在不同的物種中功能較為復(fù)雜。
　　 由此可見，近年的研究已經(jīng)闡明了昆蟲防衛(wèi)真菌的多個(gè)信號(hào)途徑，但還未完全弄清昆蟲對(duì)真菌的防衛(wèi)反應(yīng)時(shí)間、空間、參與的組織器官以及各種信號(hào)途徑在防衛(wèi)中的作用。想要了解主昆蟲何時(shí)以及如何啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答反應(yīng)以及

6、哪些組織參與抵抗真菌，可以通過分析Toll信號(hào)通路在抵抗真菌感染的過程中的激活時(shí)間和參與的組織器官進(jìn)行探討。但是，Toll信號(hào)通路涉及的相關(guān)基因較多，如果要對(duì)宿主昆蟲啟動(dòng)Toll信號(hào)通路的時(shí)空特點(diǎn)進(jìn)行深入的研究，則需要從真菌孢子侵染早期至末期對(duì)昆蟲的多個(gè)免疫組織中Toll信號(hào)通路的變化進(jìn)行研究，這樣形成的檢測樣本數(shù)量就會(huì)較多。因此，本研究首先建立了一種有效檢測多個(gè)基因在多個(gè)樣本中表達(dá)譜的方法，再以綠僵菌侵染直翅目昆蟲東亞飛蝗為材料，從綠

7、僵菌孢子在體壁萌發(fā)至侵染晚期，動(dòng)態(tài)系統(tǒng)地研究了東亞飛蝗體內(nèi)四個(gè)不同組織(脂肪體、血細(xì)胞、中腸和翅)中Toll信號(hào)通路相關(guān)基因的激活時(shí)間和表達(dá)變化情況，同時(shí)研究了通路中兩個(gè)重要基因Lmmyd88和Lmcactus的轉(zhuǎn)錄被干擾下調(diào)后東亞飛蝗抵抗真菌感染能力的變化情況。
　　 另外，本研究還首次克隆了直翅目昆蟲東亞飛蝗體內(nèi)的βgrp基因，檢測了該基因在東亞飛蝗體內(nèi)不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，研究了該基因在宿主昆蟲東亞飛蝗感染真菌

8、后的表達(dá)變化情況，同時(shí)還研究了通過RNA干擾使得該基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)后，宿主昆蟲東亞飛蝗的存活率的改變以及抵抗真菌感染能力的變化。
　　 主要研究結(jié)果有：
　　 1)建立了一種有效的檢測多重基因表達(dá)譜的技術(shù)，該技術(shù)不需要特殊儀器、操作簡便、成本低、靈敏度好，特別適合中等通量的基因表達(dá)譜檢測，該技術(shù)滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　 2)克隆了東亞飛蝗體內(nèi)Toll信號(hào)通路相關(guān)基因片段，包括：2個(gè)模式識(shí)別受體Lmgnbp-like

9、和Lmgnbp2，6個(gè)Toll信號(hào)通路相關(guān)基因Lmspatzle、Lmtoll9、Lm18wheeler、Lmmyd88、Lmtube和.Lmcactus。
　　 3)半定量RT-PCR顯示，上述8個(gè)基因在中腸中均有較高水平的表達(dá)，而脂肪體、血細(xì)胞和翅中表達(dá)則相對(duì)較低，另外，Lmspatzle基因只在翅和中腸中有表達(dá)，而在脂肪體和血細(xì)胞中無表達(dá)，Lmtoll9基因則只在中腸中有表達(dá)。
　　 4)Real-time PCR

10、結(jié)果顯示，綠僵菌侵染東亞飛蝗后，當(dāng)綠僵菌在東亞飛蝗的翅表皮上萌發(fā)(侵染后8h)時(shí)，脂肪體中的Toll通路相關(guān)基因即呈上調(diào)表達(dá)。
　　 5)多基因表達(dá)譜檢測方法分析翅、脂肪體、血細(xì)胞和中腸四個(gè)免疫器官中。Toll信號(hào)通路相關(guān)基因激活情況，結(jié)果顯示，當(dāng)綠僵菌在東亞飛蝗的翅表皮上萌發(fā)時(shí)，脂肪體中的Toll通路相關(guān)基因仍呈上調(diào)表達(dá)，結(jié)果與利用Real-time PCR檢測的結(jié)果一致；同時(shí)，模式識(shí)別受體Lmgnbp-like和Lmgnbp

11、2在翅中有上調(diào)表達(dá)，血細(xì)胞和翅中的Toll信號(hào)通路基因也呈上調(diào)表達(dá)，但時(shí)間晚于脂肪體中Toll信號(hào)通路相關(guān)基因的活化時(shí)間；但中腸中的Toll通路相關(guān)基因在真菌侵染的整個(gè)過程中未見明顯改變。
　　 6)RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，Toll信號(hào)通路基因Lmmyd88和Lmcactus轉(zhuǎn)錄下調(diào)后，東亞飛蝗抵抗真菌感染的能力發(fā)生了改變，Lmmyd88突變體抵抗真菌的能力下降，而Lmcactus突變體抵抗真菌的能力提高。
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12、)克隆獲得了β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白基因(命名為Lmβgrp)，該基因全長cDNA為1656bp，預(yù)測蛋白分子量為53kD。
　　 8)半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，生理狀態(tài)下，Lmβgrp卻在胚胎發(fā)育的整個(gè)階段都有表達(dá)，但在成蟲中僅在血細(xì)胞中有表達(dá)，而在脂肪體、中腸和翅等免疫器官中均無表達(dá)。
　　 9)定量PCR結(jié)果顯示，真菌侵染東亞飛蝗后，Lmβgrp基因及下游酚氧化酶信號(hào)通路中酚氧化酶蛋白基因(Lmppo)的轉(zhuǎn)

13、錄被誘導(dǎo)上調(diào)。
　　 10)RNA干擾實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，通過RNA干擾沉默Lmβgrp基因的轉(zhuǎn)錄后，東亞飛蝗的存活率低于未被干擾的野生組，且干擾組東亞飛蝗糞便出現(xiàn)異常的黑色稀便；感染真菌綠僵菌后，干擾組東亞飛蝗的存活率低于感染了綠僵菌的野生型東亞飛蝗。
　　 11)分析檢測東亞飛蝗腸道16s rRNA，發(fā)現(xiàn)Lmβgrp基因轉(zhuǎn)錄被干擾后，東亞飛蝗的腸道菌群種群發(fā)生改變，干擾組東亞飛蝗腸道內(nèi)檢測到了異常的創(chuàng)傷弧菌(Hbrio

14、 vulnificus)。
　　 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，直翅目昆蟲東亞飛蝗體內(nèi)也存在保守的固有免疫應(yīng)答信號(hào)途徑Toll信號(hào)通路，且該通路是東亞飛蝗體內(nèi)重要的抗真菌感染的信號(hào)途徑，宿主東亞飛蝗在真菌穿透體壁之前就能感知真菌在體表的萌發(fā)，進(jìn)而快速激活體內(nèi)多個(gè)組織(脂肪體、血細(xì)胞和體壁組織)中的Toll信號(hào)通路參與抵抗真菌的感染。另外，東亞飛蝗體內(nèi)也保守存在模式識(shí)別受體β-1，3-葡聚糖識(shí)別蛋白基因Lmβgrp，該基因參與抵抗真菌感染；同