白眉蝮蛇去整合素Adinbitor在畢赤酵母中的表達(dá)及對腫瘤細(xì)胞的作用.pdf

1、去整合素(disintegrins)為一組源于出血性蛇毒的抗黏附蛋白質(zhì)的總稱，因其可強(qiáng)力拮抗整合素(integrin)而得名。其特征為：富含半胱氨酸，并多含有Arg-Gly-Asp(RGD)或Lys-Gly-Asp(KGD)親水性氨基酸序列，分子量僅為5～9kD，多為單鏈蛋白分子[1]。因為大部分細(xì)胞整合素(integrins)都能識別RGD序列，而大多數(shù)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)蛋白成分都含有RGD序

2、列，因此去整合素可憑借其RGD識別序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)與整合素間結(jié)合的強(qiáng)有力的競爭性拮抗劑，從而抑制整合素參與的多種生理活動。 去整合素(Adinbitor)是運(yùn)用基因工程手段，從產(chǎn)于中國旅順的白眉蝮蛇(Gloydius blomhoffi brevicaudus)毒腺中獲得。即從中國白眉蝮蛇毒腺中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)NCBI上發(fā)表的同源序列反推DNA，自行設(shè)計引物，獲得了219 bp的白眉蝮蛇去整合素基因。去

3、整合素(Adinbitor)由73個氨基酸殘基組成，含有12個半胱氨酸殘基和一個去整合素特征性RGD三肽識別序列，相對分子量9KD，作為去整合素家族的新成員，可作為多種整合素受體的強(qiáng)有力的拮抗劑，具有抑制腫瘤的作用。 整合素(Integrins)是廣泛存在于動植物細(xì)胞表面的一類細(xì)胞黏附分子，它介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間及細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，參與細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞，在細(xì)胞分化，胚胎發(fā)育，凝血，組織修補(bǔ)及細(xì)胞黏附，侵襲等各方面起重要作

4、用。整合素與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，整合素可通過傳遞特定的信號或誘導(dǎo)基因表達(dá)來調(diào)控腫瘤細(xì)胞的黏附，增殖，浸潤和轉(zhuǎn)移，凋亡以及腫瘤血管的生成等。所有去整合素都具有其生物學(xué)活性所必須的RGD特異性識別序列，憑借此序列去整合素可作為多種整合素受體的強(qiáng)有力的拮抗劑，抑制整合素在腫瘤發(fā)生過程中的各種作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)去整合素能夠抑制腫瘤細(xì)胞對纖連蛋白，玻連蛋白，層粘連蛋白和膠原的黏附，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，浸潤和轉(zhuǎn)移，同時去整合素還具有誘導(dǎo)

5、腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的特異作用。 酵母作為一種后起的外源表達(dá)系統(tǒng)，由于兼具原核及真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)，正在基因工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，目前研究比較成熟的是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastors，P.pastoris)。畢赤酵母是一種單細(xì)胞真核生物，近十年來被作為真核表達(dá)系統(tǒng)而用于外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。其表達(dá)的Adinbitor在結(jié)構(gòu)和功能上更接近天然Adinbitor，有利于大量生產(chǎn)。 本論文將已經(jīng)構(gòu)建的重組質(zhì)粒pPIC9

6、K-Adinbitor在畢赤酵母GS115中表達(dá)的去整合素(rAdinbitor)，經(jīng)過層析柱純化及透析，獲得分子量為9KD的去整合素(rAdinbitor)，并對B16黑色素瘤細(xì)胞的黏附，增殖，浸潤，轉(zhuǎn)移和凋亡方面進(jìn)行研究。實(shí)驗結(jié)果表明rAdinbitor同樣可以抑制腫瘤細(xì)胞的黏附，增殖，浸潤與轉(zhuǎn)移，同時還可以呈劑量依賴性方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。 總之，本論文成功的通過基因工程手段從中國旅順的白眉蝮蛇毒腺中獲得了一個去整合素