牛乳鐵素基因的克隆及在大腸桿菌和畢赤酵母中的表達.pdf

1、乳鐵蛋白(LF)是一種具有多種生物學功能的天然活性鐵結合糖蛋白，在殺菌、抗病毒、免疫調節(jié)等方面起重要作用，是調節(jié)動物體液中自由鐵離子水平的轉鐵家族中最重要的成員。天然乳鐵蛋白主要存在于動物乳汁尤其是人初乳中，含量可達6-8mg/mL。乳鐵素是乳鐵蛋白在酸性條件下經(jīng)蛋白酶消化后從N-端釋放出來的一個小肽段，并且抗菌活性強于乳鐵蛋白。國外對牛乳鐵素、人乳鐵素、山羊乳鐵素、鼠乳鐵素等的抗菌活性進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)牛乳鐵素的抗菌活性最強。牛乳鐵

2、素(LfcinB)作為一種廣譜高效的抗菌肽，在替代傳統(tǒng)抗生素研究中顯示了巨大的潛力和廣闊的應用前景。由于自然界中的LfcinB資源有限，提取成本高，本試驗擬通過基因工程技術建立一個體外高效表達系統(tǒng)，以期為大量獲得LfcinB并進行深入研究奠定基礎。 本試驗根據(jù)GenBank中已報道的BLF基因(NO∶NM_180998)，化學合成LfcinB的單鏈基因序列。以合成的序列為模板，用相應的特異性引物擴增LfcinB基因。結果表明擴增

3、得到的PCR產物濃度高、特異性強，且大小在92bp左右。將PCR產物直接克隆到pMD18-T載體上，經(jīng)過菌落PCR鑒定和BamHⅠ/SalⅠ限制性內切酶酶切分析，初步確認目的基因已克隆入T載體。將含重組質粒的菌液送上海生物工程公司測序，結果與本試驗所合成的單鏈基因序列同源性為100％，表明擴增得到的是LfcinB基因。 PCR產物經(jīng)回收純化后用EcoRⅠ、NotⅠ限制性內切酶進行雙酶切，膠回收獲得連接用LfcinB基因片段。將原

4、核表達載體pET-22b(+)和真核表達載體pPIC9K分別用EcoRⅠ、NotⅠ限制性內切酶進行雙酶切，然后膠回收目的片段。 將酶切的PCR產物與酶切的原核表達載體pET-22b(+)連接并轉化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞，加入IPTG誘導目的蛋白的表達，分別收集誘導2h、3h、4h的菌液。同時設一個不加IPTG誘導的空白對照和一個經(jīng)IPTG誘導的非重組菌對照。經(jīng)菌落PCR鑒定、酶切分析確認LfcinB基因已經(jīng)插入了多克隆位點。

5、表達產物經(jīng)SDS-PAGE分析，結果在約3.2KD的位置有目的條帶，而對照組沒有出現(xiàn)這條帶，表明目的蛋白得到了表達，且誘導3h的表達量最高。 將酶切的PCR產物與酶切的真核表達載體pPIC9K連接，用SalⅠ線性化重組質粒，并通過原生質體轉化法轉入畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞。用G418濃度分別為0.5、0.75、1.0、1.5mg/mL的YPD平板篩選多拷貝His+轉化子，再通過多拷貝His+轉化子在MM和MD板上的生長情況進

6、一步確定轉化子的表型，最后誘導目的基因在畢赤酵母中的分泌表達。收集的上清經(jīng)冷凍干燥濃縮后進行SDS-PAGE分析，結果在分子量約為3.2KD的位置有目的產物的帶，而對照組沒有出現(xiàn)這條帶，表明該菌株可以表達目的蛋白，但目的蛋白的條帶是經(jīng)過濃縮后才被SDS-PAGE檢測到，表明表達的目的蛋白的量不是很理想。將上清液按同樣方法濃縮，用本實驗室保存的大腸桿菌對濃縮產物做抑菌試驗，初步鑒定其抗菌活性，同時設陰性對照。結果陰性對照孔沒有抑菌圈，試驗