白眉蝮蛇去整合素Adinbitor對腫瘤細胞的作用.pdf

1、去整合素(disintegrins)是從蛇毒中提取的一類同源性很高的多肽，含有Arg-Gly-Asp(RGD)序列或Lys-Gly-Asp(KGD)序列，半胱氨酸含量豐富，分子量為5～9kD[1]。因為大部分細胞整合素(integrins)都能識別RGD序列，而大多數細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)蛋白成分都含有RGD序列，故去整合素可憑借其RGD識別序列而成為細胞外基質與細胞整合素間結合的強有力的競爭性拮抗

2、劑，從而抑制整合素參與的多種生理活動。 去整合素Adinbitor是由來自于中國旅順的白眉蝮蛇又名短尾蝮(Gloydiusbrevicaudus)，學名為Agkistrodonhalysbrevicaudusstejneger的蛇毒中克隆得到的。Adinbitor由73個氨基酸殘基組成，含有12個半胱氨酸殘基和1個去整合素特征性RGD三肽識別序列，相對分子量為9kD，為去整合素家族的新成員，故可作為多種整合素受體的強有力的拮抗劑

3、，具有抑制腫瘤的作用。 腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多階段的長期復雜的過程，其細胞信號傳遞系統(tǒng)出現(xiàn)了明顯的缺陷，整合素作為信號傳導者發(fā)揮著重要作用。研究證明不同的整合素成員在腫瘤細胞內的表達水平有差異，在腫瘤發(fā)生的不同階段表現(xiàn)為截然不同的作用，表明整合素可通過傳遞特定的信號或誘導基因表達來調控腫瘤細胞的粘附、增殖、浸潤和轉移、凋亡以及腫瘤血管的生成等事件。而所有的去整合素都具有其生物學活性所必需的RGD特異性識別序列，憑借此序列去整

4、合素可作為多種整合素受體的強有力的拮抗劑，抑制整合素在腫瘤發(fā)生過程中的各種作用。已經發(fā)現(xiàn)去整合素能夠抑制腫瘤細胞對纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白和膠原的粘附，從而抑制腫瘤細胞的生長、浸潤和轉移，同時去整合素還具有誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡的特異作用。 鑒于此，本論文將凍存的新鮮陽性表達菌E.coliBL21，即其已完成帶有組氨酸標簽的重組質粒pET23b-adinbitor的轉化和鑒定，進行復蘇和IPTG的誘導表達，得到重組蛋白Adi

5、nbitor的可溶性高效表達，經組氨酸親和層析柱純化，獲得了分子量為9kD的去整合素Adinbitor，從而在去整合素Adinbitor對人胃癌細胞MGC803的增殖、凋亡、粘附、浸潤和轉移方面進行研究。 去整合素Adinbitor對人胃癌細胞MGC803增殖影響的實驗采用MTT比色法，結果表明，Adinbitor可呈劑量依賴性方式抑制MGC803細胞的增殖，其抑制MGC803細胞增殖的ID50為3.52μmol/L。在其誘導M

6、GC803細胞凋亡實驗中，采用相差顯微鏡直接觀察和蘇木精-伊紅(HE)染色進行觀察，結果顯示出細胞凋亡的典型的形態(tài)學特征如胞間連絲消失，細胞皺縮成團，胞內出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象，而且隨Adinbitor濃度的增加而越發(fā)明顯。進一步采用Hoechst染色也可檢測到Adinbitor具有誘導MGC803細胞發(fā)生凋亡的功能，在熒光顯微鏡下經紫外光激發(fā)，凋亡的細胞核發(fā)出耀眼的藍光，細胞明顯皺縮成團，并且隨Adinbitor濃度的增加，凋亡越發(fā)明顯；而未

7、經Adinbitor處理的細胞染色淡且均勻，呈均勻分布。接下來的Adinbitor對MGC803細胞的粘附抑制實驗，結果為Adinbitor對MGC803細胞粘附于纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)具有明顯的抑制作用，3.5μmol/L濃度的Adinbitor對MGC803細胞粘附于FN(2h)的抑制率約為44﹪；對粘附于人工基底膜基質Matrigel也同樣具有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。其后的轉移抑制實驗中，結果呈現(xiàn)出對經A

8、dinbitor處理的MGC803細胞從Transwell上室向下室遷移的抑制作用，并且隨著Adinbitor濃度的增加抑制作用越發(fā)增強。在采用人工基底膜基質Matrigel及Transwell模擬體內環(huán)境的浸潤抑制實驗中，也顯示出同樣具有抑制浸潤作用的結果，且也隨著Adinbitor濃度的增加抑制作用越發(fā)明顯。 總之，本論文通過誘導表達并純化獲得了重組蛋白即去整合素Adinbitor，在體外研究其對人胃癌細胞MGC803作用。