骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、創(chuàng)傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨的缺損及關(guān)節(jié)軟骨退行性病變長(zhǎng)期以來(lái)一直都是國(guó)內(nèi)外骨科界面臨的難題。近年來(lái)，將細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)與材料工程技術(shù)相結(jié)合研究開(kāi)發(fā)能修復(fù)、維持和改善病損組織功能的生物替代物即尋找合適的新型支架材料以及優(yōu)化種子細(xì)胞復(fù)合體外培養(yǎng)已是軟骨工程學(xué)的研究熱點(diǎn)[1,2]。 本研究采用組織工程學(xué)技術(shù)和干細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，將BMSCs進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并將其復(fù)合到殼聚糖，目的一方面就是利用體外培養(yǎng)骨髓問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞與組織工程細(xì)胞外

2、支架整合技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨：另一方面也擬探討殼聚糖該類支架是否為軟骨組織工程的合適的細(xì)胞載體。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為兩部分 第一部分：兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外傳代培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究目的通過(guò)貼壁培養(yǎng)法和以密度梯度離心法獲取的成年兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，探討兔髓MSCs體外擴(kuò)增、生長(zhǎng)情況。 方法以骨髓穿刺于成年新西蘭兔股骨大粗隆處獲取骨髓約3ml，用貼壁分離法和密度梯度離心法分離兔骨髓MSCs，進(jìn)行體外傳代培養(yǎng)。

3、用相差倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及其變化；所獲得的細(xì)胞用免疫組化法檢測(cè)免疫表型CD71的表達(dá)；并繪制各自的生長(zhǎng)曲線并相互比較，并取出部分爬片進(jìn)行甲苯胺蘭染色。傳代培養(yǎng)后，用RT—PCR方法檢測(cè)2，3，4這三代MSCs誘導(dǎo)組和對(duì)照組的軟骨特異性ColⅡ的mRNA的表達(dá)。 結(jié)果體外培養(yǎng)能獲得高純度的兔骨髓MSCs，并且傳代能力強(qiáng)，擴(kuò)增至20代后仍能獲得形態(tài)較為均一且主要為梭形的細(xì)胞。體外傳代后的數(shù)量培增，尤其在4-5代后表現(xiàn)更為明顯。初

4、期貼壁細(xì)胞主要呈紡錘形，并隨著傳代的次數(shù)增加而形態(tài)更為均一呈梭形。體外傳代培養(yǎng)至第5代，細(xì)胞數(shù)量較第一代增加了約20倍。所獲得的細(xì)胞具有CD71的免疫表型。細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈“S”形，具有一致的生長(zhǎng)趨勢(shì)。 結(jié)論密度梯度離心法加差速貼壁培養(yǎng)法能提高M(jìn)SCs的純度，減少污染，通過(guò)該途徑獲得的MSCs可作為軟骨組織工程種子細(xì)胞。 第二部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合殼聚糖修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的組織工程實(shí)驗(yàn)研究 目的觀察單純的殼聚糖與

5、未經(jīng)誘導(dǎo)的MSCs復(fù)合殼聚糖植入兔的骨關(guān)節(jié)軟骨缺損模型4周、8周后誘導(dǎo)異位成軟骨情況。 方法先將MSCS細(xì)胞與殼聚糖的復(fù)合培養(yǎng)，然后6只新西蘭大白兔建造全層關(guān)節(jié)軟骨缺損模型：i組為單純殼聚糖支架修復(fù)組，ii組為殼聚糖支架復(fù)合MSCS修復(fù)。分別于手術(shù)后4周、8周處死動(dòng)物，通過(guò)大體形態(tài)、甲苯胺藍(lán)染色、過(guò)碘酸一雪夫反應(yīng)(periodicacidShiftreaction，PAS)、II型膠原免疫組化觀察新生區(qū)軟骨組織修復(fù)情況。

6、 結(jié)果術(shù)后4周，i組(單純的殼聚糖修復(fù)組)僅有纖維組織增生；甲胺苯藍(lán)染色較淡；n組(MSCs復(fù)合殼聚糖修復(fù)組)關(guān)節(jié)軟骨缺損處有一定軟骨樣組織及膠原生成，雖然排列有些紊亂，但已于軟骨細(xì)胞形態(tài)有所相似；術(shù)后8周，n組關(guān)節(jié)軟骨缺損處有較明顯的軟骨組織增生，中央部分有較薄的軟骨組織生成，同時(shí)接近于正常的軟骨細(xì)胞形態(tài)；i組僅在結(jié)合正常軟骨部少量的軟骨樣組織生成；甲胺苯藍(lán)染色和免疫組化顯示ii組有表達(dá)；MSCs復(fù)合殼聚糖表達(dá)CollagenII明顯