胡桃楸酚氧化酶及殺蟲(chóng)活性物質(zhì)基礎(chǔ)的研究.pdf

1、胡桃楸（Juglans mandshurica）為核桃（Juglans regia）同屬植物，富含酚類(lèi)化合物，有關(guān)其殺蟲(chóng)活性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用模式研究報(bào)道較少。本研究以昆蟲(chóng)生理功能及免疫系統(tǒng)重要酶——酚氧化酶為活性研究靶點(diǎn)，尋找胡桃楸青果皮（青龍衣）及核桃葉中潛在的活性成分。
　　(1)本文首先以酚氧化酶為靶標(biāo)，考察不同月份、不同提取溶劑的青龍衣提取物及其三種醌類(lèi)化合物（胡桃醌、甲萘醌、1，4-萘醌）對(duì)酚氧化酶的抑制作用，并進(jìn)行小菜蛾

2、（Plutella xyllostella L.）和棉蚜(AphisgossypiiG.)兩種試蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性驗(yàn)證。結(jié)果表明，70％乙醇青龍衣提取物各月份的半數(shù)抑制濃度分別為:7月份(IC50=5.292g·L-1)＜6月份(IC50=6.947g·L-1)＜8月份(IC50=17.719g·L-1);小菜蛾殺蟲(chóng)實(shí)驗(yàn):6、7、8月份青龍衣提取物在給藥2d的致死中濃度分別為0.840g·L-1、2.663g·L-1、5.858g·L-1，給藥

3、3d的致死中濃度分別為0.328g·L-1、1.386g·L-1、1.443g·L-1，表明6月份小菜蛾致死效果＞7月份小菜蛾致死效果＞8月份小菜蛾致死效果，與酚氧化酶活性趨勢(shì)基本一致。棉蚜殺蟲(chóng)活性實(shí)驗(yàn):青龍衣提取物在給藥24h的致死中濃度分別為:7月份(LC50=0.072g·L-1)＜6月份提取物(LC50=0.296g·L-1)＜8月份(LC50=1.141g·L-1)，給藥36 h時(shí)的致死中濃度分別為:7月份(LC50=0.02

4、2g·L-1)＜6月份(LC50=0.190g·L-1)＜八月份(LC50=0.643g·L-1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明青龍衣提取物對(duì)酚氧化酶的抑制作用與殺蟲(chóng)活性規(guī)律完全一致，且胡桃楸具有良好的殺蟲(chóng)活性，證明以酚氧化酶為研究靶標(biāo)，可以快速、準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)胡桃楸中具有殺蟲(chóng)作用的活性物質(zhì)。
　　(2)為了確認(rèn)活性成分所處的部位，同時(shí)更加確認(rèn)以酚氧化酶為靶標(biāo)的可行性，對(duì)青龍衣不同萃取相進(jìn)行活性測(cè)試及棉蚜殺蟲(chóng)活性驗(yàn)證。結(jié)果表明:各萃取相對(duì)酚氧化酶的半

5、數(shù)抑制濃度比較:石油醚萃取相(IC50=4.414g·L-1)＜氯仿萃取相(IC50=7.025g·L-1)＜正丁醇萃取相(IC50=8.447g·L-1);棉蚜殺蟲(chóng)活性驗(yàn)證:給藥36h時(shí)，三相致死中濃度比較:石油醚萃取相(LC50=0.005g·L-1)＜氯仿萃取相(LC50=0.054g·L-1)＜正丁醇(LC50=0.085 g·L-1)。殺蟲(chóng)活性的變化規(guī)律與酚氧化酶活性完全一致，對(duì)酶的抑制率越高殺蟲(chóng)活性越高。
　　(3)利

6、用UPLC-MS分析方法，對(duì)三組不同溶劑提取的青龍衣樣品進(jìn)行成分分析。在確定酚氧化酶抑制活性差異基礎(chǔ)上，利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法(PLS)發(fā)掘三組樣品之間成分的差異，分析鑒定三組之間的差異代謝物。結(jié)果表明，不同溶劑青龍衣提取成分差異較大，且差異主要表現(xiàn)在次級(jí)代謝產(chǎn)物上。運(yùn)用PCA和PLS分析尋找三組之間的差異代謝物，共找到24種差異代謝物，目前鑒定出13種，其中4種萘醌類(lèi)、2種黃酮類(lèi)、1種酚酸類(lèi)、4種酯類(lèi)及2種其他化合物。

7、這些差異代謝物是青龍衣殺蟲(chóng)活性緊密相關(guān)的物質(zhì)，為我們篩選殺蟲(chóng)活性成分提供有價(jià)值的方向。
　　(4)與青龍衣不同，核桃葉對(duì)酚氧化酶是激活作用。在以小菜蛾為試蟲(chóng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)核桃葉提取物有一定的殺蟲(chóng)作用。在施藥時(shí)間為3d、4d時(shí)，6月份乙醇提取物對(duì)小菜蛾的胃毒作用的致死中濃度分別為9.561g·L-1、2.485g·L-1。之后利用UPLC-MS分析方法，對(duì)存在酶活性顯著差異不同生長(zhǎng)周期的核桃葉進(jìn)行成分分析，利用主成分分析(PCA)和偏最小

8、二乘法(PLS)發(fā)掘三組樣品之間成分的差異，分析鑒定不同生長(zhǎng)周期的差異代謝物。結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)周期成分差異較大，且差異主要表現(xiàn)在次級(jí)代謝產(chǎn)物上。運(yùn)用PCA和PLS分析尋找三組之間的差異代謝物，共得到24種差異代謝物。目前共鑒定出18種化合物，其中9種萘醌類(lèi)成分、2種黃酮及苷類(lèi)、1種酯類(lèi)、6種其他化合物。鑒于三組核桃葉樣品對(duì)酚氧化酶的激活作用與月份相關(guān)，且三個(gè)月份間呈顯著差異，這意味著這些差異代謝物是引起三個(gè)月份樣品對(duì)酶影響差異的原因。