PARP和血小板IKKβ在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用機(jī)制研究.pdf

1、論文一
　　 PARP在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的作用及機(jī)制研究
　　 背景：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化是很多心血管疾病，腦血管疾病和外周血管疾病的主要發(fā)病原因。動(dòng)脈粥樣硬化除了引起血管狹窄外，還能導(dǎo)致斑塊破裂，血栓形成，從而堵塞血管，造成嚴(yán)重的不良心腦血管事件，包括心肌梗死、腦梗死、猝死等。動(dòng)脈粥樣硬化形成的原因非常復(fù)雜。血脂異常、內(nèi)皮功能障礙、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)沉積、血管生成、膠原代謝等因素均在動(dòng)脈粥

2、樣硬化中發(fā)揮了一定的作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，內(nèi)皮功能障礙發(fā)揮了主要的作用。所以，維持內(nèi)皮的正常功能對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化意義重大。
　　 多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1）是PARP家族最主要的亞型，發(fā)揮了PARP活性的90％。PARP-1能夠以NAD+為底物通過(guò)催化ADP核糖單位結(jié)合到目的蛋白或者PARP本身進(jìn)行修飾。PARP-1在氧化應(yīng)激、亞硝酸鹽等損

3、傷DNA時(shí)，能夠識(shí)別DNA損傷，被激活。DNA損傷嚴(yán)重時(shí)，PARP過(guò)度激活，能夠引起細(xì)胞能量耗竭甚至死亡。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，PARP-1激活廣泛參與了動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、心力衰竭等各種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。
　　 抑制PARP的激活，能夠有效延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性。目前研究認(rèn)為抑制PARP激活主要通過(guò)以下機(jī)制減緩了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展:一是抑制炎癥因子的表達(dá)和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，PARP-1能

4、夠與核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（nuclearfactorkappaB，NFκB）結(jié)合，促進(jìn)NFκB的激活，抑制PARP-1能夠有效減少血管細(xì)胞粘附分子-1(vascularcelladhesionmolecule-1，VCAM-1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1，MCP-1)、E-選擇素(E-selectin)、P-選擇素(P-selectin)等炎癥因子的表達(dá)，并且通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)

5、，降低單核細(xì)胞的趨化性，減少了斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量;二是通過(guò)增加金屬蛋白酶組織抑制劑-3(tissueinhibitorofmetalloproteinase-3，TIMP-3)的表達(dá)，減少了膠原的代謝;三是通過(guò)減少內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡，維持了內(nèi)皮的完整性，減輕了壞死核心的形成;四是減少活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)和活性氮(reactivenitrogenspecies，RNS)的產(chǎn)生，減少了氧化應(yīng)激和

6、硝基化產(chǎn)物的產(chǎn)生;五是維持了內(nèi)皮的正常功能。
　　 一氧化氮(nitricoxide，NO)在內(nèi)皮功能中起了關(guān)鍵性的作用，它能夠調(diào)節(jié)血管的張力和局部血流，抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，調(diào)控白細(xì)胞和內(nèi)皮之間的相互作用，并在血栓形成中發(fā)揮了一定的作用。作為重要的血管保護(hù)分子，NO能夠有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。NO在血管系統(tǒng)主要由內(nèi)皮型NO合酶(endothelialnitricoxidesynthase，eNOS)和誘導(dǎo)型NO合酶(

7、induciblenitricoxidesynthase，iNOS)產(chǎn)生。盡管已有研究探討了PARP對(duì)eNOS、iNOS的作用，但PARP和NO生成的關(guān)系仍未明確。
　　 脂質(zhì)過(guò)氧化在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用。脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中，產(chǎn)生的毒性醛類代謝產(chǎn)物，可以與核酸/蛋白結(jié)合形成各種加合物，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷/缺失/突變以及蛋白質(zhì)失活，造成DNA和蛋白質(zhì)的功能異常，甚至可以直接損傷細(xì)胞和組織，另外某些毒性醛類可以

8、誘發(fā)和加重氧化應(yīng)激，這些都促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。醛脫氫酶類能夠?qū)⒍拘匀╊惔x成低毒性的羧化物，從而減少脂質(zhì)過(guò)氧化引起的細(xì)胞和組織的損傷。在各種醛脫氫酶類中，乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase2，ALDH2)在代謝毒性醛類物質(zhì)過(guò)程中發(fā)揮了主要的作用。PARP能否通過(guò)調(diào)控ALDH2的活性影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，目前尚缺乏這方面的研究。
　　 研究目標(biāo)：
　　 1.通過(guò)PARP抑制劑和敲基因小鼠

9、的方法，進(jìn)一步明確PARP-1對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響;
　　 2.抑制PARP激活后，觀察主動(dòng)脈NO表達(dá)的變化;
　　 3.尋找PARP調(diào)控NO表達(dá)的分子機(jī)制。
　　 4.探討PARP對(duì)ALDH2表達(dá)和活性的作用及可能的機(jī)制
　　 研究方法：
　　 1.敲基因小鼠的產(chǎn)生
　　 PARP-1-/-小鼠購(gòu)買自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室，為用于動(dòng)脈粥樣硬化的研究，將該小鼠與C57BL/6J小鼠雜交至

10、少7代。然后，將得到的C57BL/6J基因基礎(chǔ)的PARP-1-/-小鼠與apoE-/-雜交獲得實(shí)驗(yàn)用的apoE-/-和apoE-/-PARP-1-/-小鼠。
　　 2.動(dòng)脈粥樣硬化模型
　　 選擇6-8周apoE-/-小鼠或者apoE-/-PARP-1-/-小鼠分為apoE-/-小鼠+正常飲食組（control組）、apoE-/-小鼠+高膽固醇組(HD組)、apoE-/-小鼠+高膽固醇+DPQ組（HD+DPQ組）和apo

11、E-/-PARP-1-/-小鼠+高膽固醇飲食組高膽固醇飲食(HD+DKO組)，12周后發(fā)生自發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化。
　　 3.組織學(xué)染色
　　 高膽固醇飲食12周后，麻醉小鼠，采血后，取小鼠心臟和主動(dòng)脈，將胸腹主動(dòng)脈剝?nèi)ネ饽ず?，進(jìn)行油紅O染色;對(duì)主動(dòng)脈根部進(jìn)行冰凍切片后，行油紅O染色。用ImagePro-Plus軟件對(duì)胸腹主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部斑塊面積進(jìn)行測(cè)量。
　　 4.免疫組化染色
　　 對(duì)主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣

12、硬化斑塊切片后，進(jìn)行PARP激活產(chǎn)物多聚腺苷二磷酸核糖（polyADPribose，PAR），DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基-鳥嘌呤脫氧核苷酸(8-oxo-dG)和3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)的組織化學(xué)染色。
　　 5.NO含量的測(cè)量
　　 總一氧化氮含量采用經(jīng)典Griessreagent檢測(cè)亞硝酸鹽，從而測(cè)定出總一氧化氮。
　　 6.蛋白質(zhì)印跡
　　 目的蛋白的表達(dá)，采用wes

13、ternblotting的方法進(jìn)行檢測(cè)，利用β-actin作為內(nèi)參對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量。
　　 7.精氨酸酶活性檢測(cè)
　　 裂解液裂解主動(dòng)脈或者細(xì)胞，提取蛋白，加入左旋精氨酸(L-arginine)后，孵育37℃，60分鐘。酶活性表示為納摩爾尿素每毫克蛋白每分鐘(nmolurea/mgprotein/min)。
　　 8.小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　 取6到8周的小鼠，腹腔注射2ml的4％的巰基乙酸(t

14、hioglycollate)，3天后，打開(kāi)腹腔，將巨噬細(xì)胞分離出來(lái)后，鋪六孔板，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 9.小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　 麻醉小鼠后，打開(kāi)胸腔，采用心臟灌注的方法，將血液排出，取胸主動(dòng)脈，剝除外膜及結(jié)締脂肪組織，剖開(kāi)，鋪在膠原包被的六孔板上，待內(nèi)皮細(xì)胞爬出后，消化培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 10.人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanaorticendothelialcells，HAECs)的培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)
　　

15、 在37℃，5％CO2孵箱中，用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行傳代鋪板。
　　 結(jié)果：
　　 1.PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除有效延緩了動(dòng)脈粥樣硬化的形成:通過(guò)大體油紅O染色或者分析主動(dòng)脈根部斑塊的面積發(fā)現(xiàn)，與普通高膽固醇飲食的小鼠對(duì)比，抑制PARP激活能夠有效減少動(dòng)脈粥樣硬化的生成。
　　 2.PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除對(duì)血象、血脂水平無(wú)明顯影響。
　　 3.PA

16、RP抑制劑或者PARP-1基因敲除減少了主動(dòng)脈斑塊內(nèi)的氧化應(yīng)激和硝酸化產(chǎn)物的生成:通過(guò)免疫組化分析斑塊內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物8-oxo-dG和硝基化產(chǎn)物3-硝基酪氨酸的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，抑制PARP激活能夠有效減輕動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)氧化應(yīng)激和硝基化產(chǎn)物的產(chǎn)生。
　　 4.PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除增加了主動(dòng)脈NO的含量:PARP抑制劑或者PARP-1基因敲除增加了主動(dòng)脈內(nèi)NO的生成。通過(guò)分析與NO生成相關(guān)的蛋白發(fā)現(xiàn)，抑制PARP激活

17、減少了精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)及精氨酸酶的活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)抑制PARP激活雖然減少了iNOS的表達(dá)但是增加了eNOS的磷酸化水平。
　　 5.PARP-1基因敲除只影響了精氨酸酶Ⅱ的表達(dá)，對(duì)精氨酸酶Ⅰ沒(méi)有明顯的影響:在氧化低密度脂蛋白刺激下，發(fā)現(xiàn)PARP-1基因敲出能阻止小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)精氨酸酶Ⅱ的增加，但精氨酸酶Ⅰ的表達(dá)沒(méi)有明顯改變。
　　 6.PARP-1基因敲除增加了小鼠內(nèi)皮細(xì)胞NO的生成。
　　 7.抑制PARP

18、激活增強(qiáng)了HAECs中ALDH2的活性:Ox-LDL刺激HAECs，能夠抑制ALDH2的活性，并呈時(shí)間和濃度依賴性，但沒(méi)有改變ALDH2的蛋白表達(dá)。PARP抑制劑能夠部分阻止ox-LDL引起的ALDH2活性的抑制。
　　 結(jié)論：
　　 PARP抑制劑或PARP-1基因敲除有效延緩了動(dòng)脈粥樣硬化的形成。抑制PARP活性能夠減少ArgⅡ的表達(dá)，增加eNOS的磷酸化水平，從而增加了NO的表達(dá)，維持了內(nèi)皮的正常功能;另外，抑制P

19、ARP活性能夠阻止ox-LDL引起的ALDH2活性下降。
　　 論文二
　　 血小板IKKβ在動(dòng)脈粥樣硬化形成及新生內(nèi)膜增生中的作用機(jī)制研究
　　 背景：
　　 白細(xì)胞在血管內(nèi)皮上的滾動(dòng)、粘附和侵潤(rùn)是動(dòng)脈粥樣硬化形成的關(guān)鍵因素。動(dòng)脈粥樣硬化最初是由內(nèi)皮功能障礙或內(nèi)皮損傷開(kāi)始的，內(nèi)皮在TNFα、LPS、血脂異?；驒C(jī)械性損傷刺激后，表達(dá)P選擇素糖蛋白配體1(PSGL-1)、VCAM-1等炎癥粘附分子或暴露內(nèi)皮

20、膠原，引起血液中白細(xì)胞、血小板等在內(nèi)皮表面上滾動(dòng)和粘附，白細(xì)胞粘附在血管內(nèi)皮后，在PECAM-1、ICAM-1等分子作用下，侵潤(rùn)至內(nèi)皮下，并在各種炎癥因子作用下逐漸變?yōu)榫奘杉?xì)胞，吞噬脂質(zhì)、死細(xì)胞等，形成血管局部的病灶，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。
　　 血小板是來(lái)源于骨髓巨核細(xì)胞的細(xì)胞碎片，有完整的細(xì)胞膜，但沒(méi)有細(xì)胞核。血小板的主要功能是介導(dǎo)凝血、止血和修復(fù)損傷血管。近幾年發(fā)現(xiàn)血小板除了上述功能外，還在動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥、免疫

21、和腫瘤轉(zhuǎn)移等疾病中發(fā)揮非常重要的作用。血小板可以在激活物如ADP、凝血酶、血栓烷A2、膠原等作用下發(fā)生激活、釋放、聚集和粘附等改變。血小板能夠參與白細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面上的滾動(dòng)和粘附進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。血小板介導(dǎo)白細(xì)胞的滾動(dòng)和粘附，主要有兩個(gè)方面的機(jī)制:一是血小板首先通過(guò)血小板膜上的GPIbα、GPVI、α2β1、α(II)bβ3、JAM-A、JAM-C和CX3CR1等分子與內(nèi)皮細(xì)胞表面的vWF因子或者內(nèi)皮下膠原的結(jié)合，粘附在血管

22、的內(nèi)皮的表面，然后血小板再通過(guò)膜表面上的P-選擇素與白細(xì)胞表面的PSGL-1相互作用，激活白細(xì)胞上Mac-1分子，最后血小板膜上的GPIbα分子與白細(xì)胞表面上的Mac-1分子結(jié)合，使白細(xì)胞緊密的粘附在血管內(nèi)皮表面上;二是“蹭灰”機(jī)制，激活的血小板能夠與白細(xì)胞相互作用，將血小板表面上的P-選擇素、CCL5等分子通過(guò)血小板膜與白細(xì)胞膜融合的方式轉(zhuǎn)移到白細(xì)胞上，進(jìn)而增強(qiáng)白細(xì)胞的粘附功能。
　　 核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(nuclearf

23、actorkappaB，NF-κB)是炎癥、免疫、凋亡和細(xì)胞增值等的關(guān)鍵調(diào)控分子，參與了包括炎癥因子在內(nèi)的超過(guò)150種基因的表達(dá)。正常情況下，NF-κB與它的抑制蛋白IκBα結(jié)合在一起，并不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)IκBα在IκB激酶(IκBkinase，IKK)作用下發(fā)生磷酸化降解后，NF-κB被釋放并發(fā)生核轉(zhuǎn)位與細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)結(jié)合，NF-κB才能發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用。IKK有多個(gè)亞型，包括α、β、γ和新發(fā)現(xiàn)的ε四個(gè)亞型。其中，

24、IKKβ在磷酸化IκBα過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。利用IKKβ的條件性敲基因小鼠，發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞中的NF-κB激活情況在動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮了不同的作用。內(nèi)皮細(xì)胞的IKKβ敲除后能夠減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，而單核細(xì)胞里面的IKKβ敲除后卻促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　 近幾年發(fā)現(xiàn)，除了有核細(xì)胞具有NF-κB系統(tǒng)外，血小板也含有功能性的NF-κB系統(tǒng)。以往的研究表明，激活的血小板能夠促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展和損傷血管的內(nèi)膜增厚。但是血小板

25、中的NF-κB被抑制后對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化有什么影響還缺乏相關(guān)方面的研究。因此，本課題主要圍繞著血小板中的NF-κB在血小板激活、釋放和聚集中的作用以及通過(guò)條件性基因敲除的方法抑制血小板中的NF-κB后對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和血管內(nèi)膜增厚的影響進(jìn)行。
　　 研究目標(biāo)：
　　 1.運(yùn)用loxp-Cre系統(tǒng)，構(gòu)建血小板特異性IKKβ敲基因小鼠;
　　 2.西方飲食飼養(yǎng)小鼠12周，觀察血小板IKKβ基因敲除后對(duì)自發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化的影

26、響;
　　 3.通過(guò)導(dǎo)絲損傷頸動(dòng)脈內(nèi)皮，觀察血小板IKKβ基因敲除后對(duì)新生內(nèi)膜增厚的影響;
　　 4.探討IKKβ基因敲除后對(duì)血小板功能的影響及機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1.血小板IKKβ特異性基因敲除小鼠的產(chǎn)生
　　 運(yùn)用loxp-Cre系統(tǒng)構(gòu)建血小板IKKβ特異性基因敲除小鼠。對(duì)PF4-Cre小鼠和floxed的IKKβ小鼠進(jìn)行雜交產(chǎn)生IKKβfl/fl/PF4cre小鼠，IKKβfl/

27、fl/PF4cre小鼠即為血小板IKKβ基因敲除的小鼠。
　　 2.建立動(dòng)脈粥樣硬化模型
　　 IKKβfl/fl/PF4cre小鼠與Ldlr-/-小鼠雜交產(chǎn)生Ldlr-/-IKKβfl/fl/PF4cre及對(duì)照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠，給予西方飲食12周，對(duì)比自發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化的大小。
　　 3.新生內(nèi)膜增厚動(dòng)物模型的建立
　　 首先，西方飲食飼養(yǎng)Ldlr-/-IKKβfl/fl/PF4cr

28、e及對(duì)照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠2周，在解剖鏡下，從頸外動(dòng)脈切口，利用導(dǎo)絲損傷小鼠的左頸總動(dòng)脈5次，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠西方飲食4周，對(duì)頸總動(dòng)脈的內(nèi)膜增厚進(jìn)行測(cè)量。
　　 4.血脂及血象分析
　　 血漿甘油三酯含量，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白和總膽固醇用自動(dòng)酶標(biāo)生化儀檢測(cè)，血液中的白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞含量用Hemavet儀器檢測(cè)。
　　 5.骨髓移植
　　 Ldlr-/-小鼠在致死劑量

29、的射線照射后，采用尾靜脈注射法注射其他小鼠來(lái)源的骨髓細(xì)胞，包括IKKβfl/fl/PF4cre及對(duì)照Ldlr-/-IKKβfl/fl小鼠。讓骨髓移植的小鼠恢復(fù)4周后，進(jìn)行頸動(dòng)脈損傷引起的內(nèi)膜增厚實(shí)驗(yàn)。
　　 6.中性粒細(xì)胞耗竭對(duì)新生內(nèi)膜增厚影響實(shí)驗(yàn)
　　 為了探討中心粒細(xì)胞在內(nèi)膜增厚中的作用，通過(guò)腹腔注射抗PMN抗體，耗竭血液循環(huán)中的中性粒細(xì)胞，進(jìn)而判斷中心粒細(xì)胞在血小板IKKβ在影響新生內(nèi)膜增厚中的作用。
　　

30、 7.Movat染色
　　 利用Movat染色技術(shù)對(duì)血管內(nèi)膜和外膜的厚度進(jìn)行測(cè)量。
　　 8.免疫組化染色
　　 選擇抗F4/80抗體，對(duì)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞的含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 9.白細(xì)胞在損傷血管內(nèi)皮表面的粘附實(shí)驗(yàn)
　　 損傷頸動(dòng)脈后，對(duì)在損傷血管表面上滾動(dòng)和粘附的白細(xì)胞數(shù)在活體熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)算。
　　 10.白細(xì)胞在激活的血小板上的粘附實(shí)驗(yàn)
　　 從小鼠心臟

31、小心抽取血液，用檸檬酸鈉抗凝，分離獲得血小板并稀釋為2×109/ml，鋪于方形的玻璃毛細(xì)管中，待血小板粘附于毛細(xì)管后，用凝血酶刺激激活血小板，連接小鼠的右頸動(dòng)脈，使小鼠血液流過(guò)毛細(xì)玻璃管，在活體熒光顯微鏡下觀察白細(xì)胞在血小板表面的滾動(dòng)和粘附情況。
　　 11.血小板的激活，聚集及釋放實(shí)驗(yàn)
　　 分離小鼠血小板后，洗滌血小板，在凝血酶、膠原和ADP刺激下，觀察血小板IKKβ的敲除對(duì)血小板激活、聚集和釋放的影響。
　　

32、 12.流式細(xì)胞術(shù)
　　 利用流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)分離血小板的純度進(jìn)行鑒定，并對(duì)血小板表面上的P-選擇素、GPIbα、GPV、GPVI、GPIX、α(II)bβ3等蛋白的量進(jìn)行檢測(cè)。
　　 13.血小板的電鏡觀察
　　 在凝血酶的刺激下，電鏡下觀察血小板的聚集及α顆粒的釋放情況。
　　 14.蛋白印跡實(shí)驗(yàn)
　　 對(duì)血小板內(nèi)在不同刺激下GPIbα、ADAM17、P38及p-P38的蛋白表達(dá)，采用west

33、ernblotting的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
　　 結(jié)果：
　　 1.西方飲食12周后，未發(fā)現(xiàn)血小板IKKβ的敲除對(duì)自發(fā)性動(dòng)脈粥樣硬化的形成有明顯的影響(P＞0.05)。
　　 2.血小板IKKβ的敲除，增加了頸動(dòng)脈損傷后新生血管內(nèi)膜的厚度，并增加了斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量。骨髓移植實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)了血小板IKKβ的敲除促進(jìn)了新生血管內(nèi)膜的增厚。
　　 3.血小板IKKβ的敲除沒(méi)有對(duì)血小板在血管內(nèi)皮表面上的粘附產(chǎn)生

34、明顯的影響，但增加了中心粒細(xì)胞在損傷血管內(nèi)皮表面上的粘附。通過(guò)活體熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)血小板IKKβ的敲除對(duì)白細(xì)胞在損傷血管內(nèi)皮或激活的血小板表面上的滾動(dòng)沒(méi)有明顯的影響，但是明顯增加了粘附在損傷血管內(nèi)皮或激活的血小板表面上的白細(xì)胞的數(shù)量。
　　 4.血小板IKKβ的敲除，減輕了血小板的激活、聚集和釋放:在凝血酶的刺激下，發(fā)現(xiàn)血小板激活的標(biāo)志P選擇素在IKKβ敲除的血小板中的表達(dá)受到明顯的抑制。通過(guò)測(cè)量血小板的ATP的釋放及電鏡觀

35、察，發(fā)現(xiàn)IKKβ敲除后血小板的聚集和釋放也受到了明顯的抑制。
　　 5.血小板IKKβ的敲除，減少了血小板表面上GPIbα、GPV的脫落，但對(duì)血小板表面GPVI、GPIX和α(II)bβ3的含量沒(méi)有明顯的影響。
　　 6.通過(guò)蛋白印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，血小板IKKβ的敲除能夠減少P-38的磷酸化，阻止ADAM的成熟，進(jìn)而減少GPIbα的脫落。
　　 結(jié)論：
　　 1.血小板IKKβ的敲除能夠促進(jìn)損傷血管的新生內(nèi)膜