PD-1對小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)在動脈粥樣硬化形成中的作用.pdf

1、目的：目前，動脈粥樣硬化在我國的患病率和發(fā)病率呈顯著上升趨勢，并已成為我國老年人的主要病死原因之一。最近的研究表明，炎癥及免疫反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。免疫細(xì)胞，特別是炎性細(xì)胞的浸潤、激活及增殖在易損性動脈粥樣硬化斑塊的形成和進(jìn)展中發(fā)揮著極為重要的作用。細(xì)胞程序性死亡受體1（PD-1）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種介導(dǎo)免疫抑制信號的共刺激分子受體，在激活的T細(xì)胞、B細(xì)胞和一些髓樣細(xì)胞上表達(dá)。近年來，人們發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-Ls路

2、徑與急慢性炎癥、腫瘤、免疫耐受、自身免疫性疾病等密切相關(guān)。因為動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展與免疫及炎癥反應(yīng)有著密切的聯(lián)系，所以PD-1及其通路可能對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮了重要調(diào)控作用。因此本研究旨在利用PD-1和ApoE雙基因缺陷小鼠，來研究PD-1信號通路在動脈粥樣硬化發(fā)展中的作用。
　　方法：將PD-1-/-小鼠和 ApoE-/-小鼠進(jìn)行交配，獲得 PD-1-/-ApoE-/-雙基因敲除小鼠。以同齡野生型PD-1+/+ApoE

3、-/-小鼠作為對照組，分別測定6周時小鼠體重、血清三酰甘油、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的基線水平。兩組小鼠在高脂喂養(yǎng)12周后，再次檢測其體重、血清三酰甘油、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的水平。小鼠麻醉后，打開胸腔，用注射器穿刺左心室，用冷磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗左心腔和主動脈腔內(nèi)的殘余血液。自升主動脈處分離心臟與主動脈，并切除心臟下半部分，心臟上半部分用冷PBS沖洗殘血后，包埋于OCT。鈍性分離自主動脈弓至腹主動脈分叉處的主動脈節(jié)段

4、，用冷 PBS沖洗殘血后，取標(biāo)本進(jìn)行分析。用油紅染色法觀察標(biāo)本動脈粥樣硬化情況。同時，利用免疫組化方法分析斑塊內(nèi)CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞數(shù)量或比例變化。利用流式細(xì)胞儀檢測脾細(xì)胞總數(shù)、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及細(xì)胞表面 CD26L、CD25的表達(dá)水平。利用細(xì)胞純化柱純化 CD4+和 CD8+T細(xì)胞用CFSE標(biāo)記，從正常小鼠分離樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，經(jīng)LDL處理后，按不同比例與CD4+和CD

5、8+T細(xì)胞混合，經(jīng)FACS檢測確定CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖情況。將純化后的CD4+和CD8+T細(xì)胞經(jīng)抗CD3抗體激活，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測上清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的含量。同時，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測高脂喂養(yǎng)12周后小鼠空腹血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α的水平。
　　結(jié)果：6周基線和高脂喂養(yǎng)12周末，實驗組和對照組小鼠的體重、血清三酰甘油、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇水平均無顯著性差異；高脂喂養(yǎng)12周后，

6、PD-1-/-ApoE-/-小鼠主動脈弓和降主動脈內(nèi)膜內(nèi)動脈粥樣硬化斑塊較對照組顯著增多，管腔嚴(yán)重狹窄，主動脈根部切片顯示動脈粥樣硬化斑塊面積是對照組的約2倍[（0.51±0.08）mm2 vs（0.29±0.06）mm2，P＜0.001]。免疫組織化學(xué)分析顯示，12周高脂喂養(yǎng)后，實驗組斑塊內(nèi) CD3+T淋巴細(xì)胞含量為（154.88±36.64）個/mm2，較對照組的（59.38±25.28）個/mm2顯著增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2

7、.14， P<0.01）。進(jìn)一步分析斑塊內(nèi)細(xì)胞的組成顯示，PD-1-/-ApoE-/-實驗組斑塊內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量是對照組的約3倍，CD8+T淋巴細(xì)胞也較對照組明顯增加。巨噬細(xì)胞的數(shù)量在PD-1-/-ApoE-/-實驗組斑塊中也有增多，但平滑肌細(xì)胞的數(shù)量則在兩組中無顯著性差異。實驗組脾臟中細(xì)胞總數(shù)、CD4+、CD8+T細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，其中CD3+CD62L-、CD3+CD25+細(xì)胞的表達(dá)也顯著增高。而且，實驗組T細(xì)胞經(jīng)CD3

8、抗體激活后分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α能力顯著增強(qiáng)。當(dāng)T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞共孵后，其增殖能力較對照組更強(qiáng)。12周高脂喂養(yǎng)后，實驗組小鼠血清中TNF-α的水平較對照組顯著增高，而IL-2、IFN-γ的濃度無顯著差異。
　　結(jié)論：本研究通過觀察PD-1-/-ApoE-/-雙基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的加速進(jìn)展、斑塊內(nèi)細(xì)胞成分的變化以及T細(xì)胞功能的改變，提示了在激活的T細(xì)胞中PD-1/PD-Ls信號通路下調(diào)參與了動脈粥樣硬