何首烏FmSTS2基因的克隆、鑒定和其與二苯乙烯苷合成關(guān)系分析.pdf

1、藥用植物何首烏(Fallopia multiflora Thunb.)是著名的傳統(tǒng)大宗中草藥材，其具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須黑發(fā)、養(yǎng)心安神等功效。何首烏的主要化學(xué)成分包括二苯乙烯類(stilbenes)、蒽醌類(anthraquinones)、磷脂類(lecithin)。其中最重要的就是其主要藥效成分二苯乙烯苷，即2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙（2，3，5，4'-tetrahydroxystibene-2-O-

2、β-D-glucoside，TSG）?，F(xiàn)代藥理學(xué)已經(jīng)證實(shí)二苯乙烯苷具有抗菌、消炎、抗腫瘤、酪氨酸酶抑制等多種生物活性，并在降血脂、抗衰老、保護(hù)心血管及抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面有很好的應(yīng)用前景。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)何首烏中二苯乙烯苷的生物活性，藥理作用等研究較為透徹，而對(duì)其在何首烏中的代謝合成途徑和關(guān)鍵酶、基因的研究卻未見報(bào)道。同時(shí)由于二苯乙烯苷在何首烏藥材中的含量較為微少，其含量變化具有組織特異性，時(shí)序性，和空間限制性，限制了其廣泛應(yīng)用。對(duì)二苯乙烯

3、苷在何首烏中合成關(guān)鍵酶、基因的研究將為后續(xù)利用次生代謝工程調(diào)節(jié)二苯乙烯苷產(chǎn)量、滿足人類日益增長(zhǎng)的藥用保健需求及植物防御、作物品質(zhì)改良提供幫助。同時(shí)也是對(duì)植物二苯乙烯類次生代謝物質(zhì)合成，調(diào)控機(jī)制的豐富和發(fā)展。因此對(duì)何首烏中二苯乙烯苷合成途徑中相關(guān)酶、基因的研究具有十分重要的意義。
　　 已有研究表明白藜蘆醇等二苯乙烯類物質(zhì)來源于苯丙氨酸途徑。苯丙氨酸代謝途徑，起始分子為苯丙氨酸，在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化下產(chǎn)物為肉桂酸(Ci

4、nnamic acid);接下來肉桂酸4-羥基化酶(C4H)在肉桂酸的對(duì)位點(diǎn)上催化位置特異性的羥化反應(yīng)，將反式肉桂酸催化生成對(duì)-香豆酸，是為苯丙氨酸途徑的第二步反應(yīng)。而4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)作用于苯丙酸途徑中最后一步反應(yīng)，催化各種羥基肉桂酸生成相應(yīng)的硫酯包括肉桂酰輔酶A和香豆酰輔酶A。白藜蘆醇等二苯乙烯類物質(zhì)的二苯乙烯母核是以苯丙氨酸途徑產(chǎn)生的香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A和為底物，由二苯乙烯合成酶(stilbenesynthas

5、e，STS)催化合成，再經(jīng)修飾、聚合等作用形成結(jié)構(gòu)不同的二苯乙烯類物質(zhì)。可見二苯乙烯合成酶是許多二苯乙烯類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶。而何首烏中是否存在二苯乙烯合成酶，以及該酶是否與二苯乙烯苷的合成相關(guān)還不清楚。為了深入研究何首烏中二苯乙烯苷的生物合成途徑中相關(guān)酶、基因，為今后利用基因工程技術(shù)提高二苯乙烯苷類的含量滿足藥用保健需求奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步了解植物二苯乙烯類物質(zhì)合成調(diào)控機(jī)制，本課題針對(duì)何首烏中的二苯乙烯合成酶基因進(jìn)行研究。
　

6、　 目的和意義:克隆何首烏中的二苯乙烯合成酶基因并進(jìn)行酶催化反應(yīng)鑒定，研究二苯乙烯合成酶基因在何首烏各組織的表達(dá)與二苯乙烯苷表達(dá)的關(guān)系，為研究二苯乙烯合成酶基因在二苯乙烯苷合成及其調(diào)控中的功能、二苯乙烯苷生物合成途徑以及今后利用基因工程技術(shù)提高二苯乙烯苷類的含量滿足藥用保健需求奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法和內(nèi)容:
　　 1.何首烏總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
　　 取何首烏的新鮮塊根用百泰克RNA提取試劑盒抽提RNA，

7、以O(shè)ligo dT18為引物按Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第1條鏈的合成。
　　 2.何首烏二苯乙烯合成酶基因cDNA全長(zhǎng)序列的獲得
　　 依據(jù)STS基因家族的蛋白保守區(qū)域，主要是何首烏近緣物種大黃和虎杖等的STS基因序列設(shè)計(jì)引物，以獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增何首烏STS的保守區(qū)片段。根據(jù)STS保守區(qū)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)RACE特異性引物。利用提取的RNA，采用Invitrogen公司的5'RACE Syste

8、m for Rapid Amplification of cDNAEnds，Version2.0試劑盒獲得該基因的5'端序列。采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒獲得該基因的3'端序列。兩端RACE的第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化、連接至PMD-18T，轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆測(cè)序。拼接后獲得何首烏STS基因cDNA的全長(zhǎng)序列。命名為FmSTS2，獲取GeneBank登錄號(hào)。

9、
　　 3.FmSTS2的原核表達(dá)
　　 以何首烏cDNA為模板，擴(kuò)增FmSTS2的開放閱讀框。將純化回收的PCR產(chǎn)物與和表達(dá)載體pET28a用T4DNA連接酶連接，使FmSTS2 N端融合pET28a(+)載體上的6×His標(biāo)簽，可以高度親和Ni2+。轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)菌，涂布含50mg/L卡那霉素(Kan)的固體LB平板。長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。挑取陽性單克隆，用含Kan的LB液體培養(yǎng)基37℃，20

10、0 rpm振蕩培養(yǎng)，OD600=0.6時(shí)，加入1 mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。首先將誘導(dǎo)溫度設(shè)為30℃[6]，將菌液分別誘導(dǎo)4h、5h、6h、7h、8h、9h后，離心收集菌體，用2ml磷酸鉀緩沖液(PH=7.5)懸浮，冰上超聲10min，離心后取上清進(jìn)行可溶性蛋白的SDS-PAGE分析，得到最佳誘導(dǎo)時(shí)間。在最佳誘導(dǎo)時(shí)間的條提下，SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)溫度分別為20、23、25、28、30、35℃時(shí)可溶性蛋白的表達(dá)情況。
　　

11、4.融合蛋白的分離純化
　　 按照得到的最佳誘導(dǎo)溫度和時(shí)間誘導(dǎo)菌液表達(dá)可溶性蛋白，將超聲過的菌液4℃條件下10，000 g離心10min。上清液過Ni-NTA親和樹脂層析柱純化融合蛋白。用含有0.5m NaCl和40 mM咪唑的0.1M的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)平衡柱子后用含有400 mM咪唑的0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)洗脫洗脫重組蛋白。收集洗脫下來的組分并進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。將純化的蛋白溶液透析過夜后置于-80

12、℃，冷凍成冰后置于凍干機(jī)中真空冷凍干燥成粉末。
　　 5.酶活性鑒定
　　 反應(yīng)體系包括150μM的香豆酰輔酶A，280μM的丙二酰輔酶A，10μg純化后的重組蛋白和0.1M磷酸鉀緩沖液(pH7.5)共250μL。35℃條件下孵育30分鐘。反應(yīng)產(chǎn)物用250μL的醋酸乙酯萃取兩次，真空干燥后，用50μl的80％(v/v)乙醇溶解作為待測(cè)液。采用HPLC進(jìn)行酶催化產(chǎn)物的分析。色譜條件:迪馬C18(4.6mm×250mm，5μ

13、m);流動(dòng)相為乙腈-水(25∶75);流速1ml/mim檢測(cè)波長(zhǎng)306 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量10μl。
　　 6.HPLC檢測(cè)何首烏各個(gè)組織二苯乙烯苷含量
　　 取同一株何首烏的塊根，老藤，莖，葉片液氮研磨成粉末置于55℃烘干25h。過80目篩，取粉末0.2g溶于25ml50％乙醇冷浸過夜，0.45μM濾膜過濾待測(cè)。0.004g標(biāo)準(zhǔn)品二苯乙烯苷溶于10ml(50％乙醇)作為對(duì)照品，過濾待測(cè)。色譜條件:迪馬C18(4.

14、6mm×250mm，5μm);流動(dòng)相乙腈-水(25∶75);流速1ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)320nm，柱溫25℃;進(jìn)樣量10μl。
　　 7.RT-PCR檢測(cè)FmSTS2在何首烏各個(gè)組織的表達(dá)
　　 按1法分別對(duì)6中同一株何首烏的塊根，老藤，莖，葉進(jìn)行RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄。將各組織的cDNA總量調(diào)成50ng/μl，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增FmSTS2。Actin(Ⅰ)作為內(nèi)參。
　　 主要結(jié)果:
　　 1.何首烏

15、STS保守區(qū)的擴(kuò)增和全長(zhǎng)的獲得
　　 擴(kuò)增何首烏二苯乙烯合成酶基因保守區(qū)，測(cè)序得到780bp左右大小的片段。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，5'RACE電泳結(jié)果顯示在850bp左右得到目的條帶;3'RACE電泳結(jié)果顯示在250左右擴(kuò)增得到目的條帶，將PCR產(chǎn)物回收克隆T載體后進(jìn)行測(cè)序，通過序列拼接獲得含有一個(gè)完整編碼區(qū)的基因序列，命名為FmSTS2(GenBank登錄號(hào)為:JX914503)，全長(zhǎng)cDNA序列為1644bp，包括441bp的

16、5'非翻譯區(qū)(UTR)，66bp的3'UTR1137bp的ORF,編碼378個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白分子量大小為42kDa。
　　 2.FmSTS2基因的原核表達(dá)和鑒定
　　 SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的空白對(duì)照菌無目的蛋白條帶產(chǎn)生，可溶性的重組蛋白在42 kDa處出現(xiàn)條帶，并且隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而增加，但到7h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大。而可溶性蛋白在28℃之前表達(dá)量依次增多，到28℃達(dá)到最大值。HPLC色譜圖顯示，酶

17、催化產(chǎn)物供試液與白藜蘆醇對(duì)照品具有相同的保留時(shí)間峰(13.24min)。說明催化產(chǎn)物主要為白藜蘆醇，說明原核表達(dá)蛋白具有二苯乙烯合成酶的活性。說明克隆的酶基因?yàn)槎揭蚁┖铣擅富颉?br>　　 3.何首烏中FmSTS2的表達(dá)和二苯乙烯苷含量的關(guān)系分析
　　 HPLC結(jié)果經(jīng)分析之后得到二苯乙烯苷在何首烏中各個(gè)組織的含量。結(jié)果顯示塊根中二苯乙烯苷含量最高(3.37％)，老藤其次(0.78％)，而莖(0.06％)和葉(0.007％)

18、中的含量很低。RT-PCR檢測(cè)FmSTS2基因在何首烏不同組織中的表達(dá)，電泳結(jié)果表明，作為內(nèi)參的細(xì)胞核基因Actin(Ⅰ)在何首烏各個(gè)組織表達(dá)一致，而FmSTS2在塊根中的表達(dá)量最高，其次是老藤，在幼莖和葉片中表達(dá)微量。
　　 主要結(jié)論:從傳統(tǒng)中藥材何首烏的塊根中克隆到一種二苯乙烯合酶FmSTS2，其互補(bǔ)cDNA全長(zhǎng)1644bp，成功構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的重組蛋白具有催化合成二苯乙烯類物質(zhì)白藜蘆醇的活性。該基因在何首烏不同組織