何首烏中二苯乙烯苷的制備及抗氧化機(jī)理研究.pdf

1、何首烏(PolygonummultiflorumThunb)為蓼科多年生草本植物的塊根，是我國(guó)傳統(tǒng)的延年益壽的中草藥。何首烏中主要的功效性成分二苯乙烯苷近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道了其多項(xiàng)生理功能：抗氧化、清除自由基；抗腫瘤；降低膽固醇；抑制動(dòng)脈粥樣狀硬化；保護(hù)肝臟；具有血管舒張作用；防治老年癡呆；提高記憶等功效。其間以抗氧化、清除自由基性能最為突出。故本課題以貴州何首烏為原料，建立了分離純化的工藝路線，分離制備得到二苯乙烯苷晶體，深

2、入探討了二苯乙烯苷抗氧化性能及抗氧化機(jī)理，為進(jìn)一步研究何首烏的藥理提供了理論基礎(chǔ)。 在分析選取何首烏原料后，研究二苯乙烯苷的分離提取工藝。運(yùn)用溶劑提取、殼聚糖絮凝澄清、大孔吸附樹脂分離技術(shù)分離純化何首烏中二苯乙烯苷。首先，通過(guò)單因素、中心組合實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了水提取工藝條件，得到最佳條件為：固-液比1∶15，溫度50℃，時(shí)間40min。而后，對(duì)水提濃縮液選用殼聚糖為絮凝劑進(jìn)行了澄清以除去蛋白、果膠等大分子雜質(zhì)，通過(guò)正交

3、實(shí)驗(yàn)得到最佳條件為：殼聚糖添加量：0.3mg/mL，pH值4.5，溫度20℃。最后，對(duì)15種大孔吸附樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選出5種吸附率高，解吸效果良好的樹脂進(jìn)行了靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)、靜態(tài)吸附等溫線方程的擬和實(shí)驗(yàn)，考察了樹脂的吸附速率以及溶液濃度與飽和吸附量了的關(guān)系，最終選出大孔吸附樹脂HPD100作為分離純化二苯乙烯苷的最佳樹脂。繼而分別對(duì)樹脂的動(dòng)態(tài)吸附條件：進(jìn)樣濃度、流速、進(jìn)樣pH值、洗脫溶液進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定相關(guān)柱條件，洗脫方式為

4、先用20％乙醇洗脫除去部分雜質(zhì)，在用40％乙醇洗脫目標(biāo)產(chǎn)物二苯乙烯苷，使得最終產(chǎn)物純度為84.47％，得率為75.12％。 應(yīng)用聚酰胺柱層析系統(tǒng)初步純化了何首烏的乙醇粗提液，而后通過(guò)溶劑結(jié)晶技術(shù)，首次分離得到了二苯乙烯苷白色針狀晶體，液-質(zhì)(LC-MS)聯(lián)用測(cè)定純度為99.49％，相對(duì)分子質(zhì)量為406；通過(guò)核磁共振分析(NMR)鑒定其結(jié)構(gòu)；并運(yùn)用X-射線衍射、差示掃描量熱分析(DSC)、熱重分析(TGA)等技術(shù)對(duì)晶體性質(zhì)進(jìn)行了初

5、步測(cè)定，證明二苯乙烯苷不存在同質(zhì)多晶現(xiàn)象，僅有一種針狀晶體存在形式，且不含結(jié)晶水，熔點(diǎn)為151.33℃。 以BHT、Vc、白藜蘆醇(RE)為對(duì)照，分別對(duì)二苯乙烯苷(SG)、大孔吸附樹脂分離樣品(RF-SG)、何首烏粗提物(C-SG)體外抗氧化性能進(jìn)行測(cè)定?？疾炝藖営退狍w系抗氧化性，還原性，DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基、H2O2清除能力以及金屬鏊合性。得出結(jié)論：從何首烏中提取的不同純度的二苯乙烯苷樣品均具有抗氧化、清除自由

6、基功能。其活性強(qiáng)弱依次為SG、RF-SG、C-SG。與常用抗氧化劑BHT、Vc對(duì)照，SG亞油酸體系抗氧化性、還原性、清除DPPH自由基能力相對(duì)較弱；而清除超氧陰離子、羥基自由基、H2O2能力要高于BHT、Vc。而與結(jié)構(gòu)相似的RE對(duì)照，SG優(yōu)于RE，原因是在結(jié)構(gòu)上SG比RE多形成了一個(gè)(2-O-Glu)糖苷；由此2-糖苷的推電子效應(yīng)，可以使對(duì)位羥基(C5-OH)所形成的苯氧自由基更為穩(wěn)定，以便終止自由基鏈反應(yīng)，從而提高抗氧化能力。

7、 通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算，分別從分子的前線軌道理論，各原子的凈電荷數(shù)，以及苯氧自由基的生成熱等方面，推測(cè)出二苯乙烯苷苯環(huán)上C5-OH、C4'-OH抗氧化的活性較強(qiáng)。 為了進(jìn)一步討論構(gòu)效關(guān)系，將二苯乙烯苷酶解，比較二苯乙烯苷與苷元的清除DPPH自由基效果，因?yàn)檐赵嬖卩徫环恿u基形成分子內(nèi)氫鍵，苷元清除DPPH自由基能力高于二苯乙烯苷。 在測(cè)定了二苯乙烯苷體外抗氧化、清除自由基作用基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了二苯乙烯苷小鼠體內(nèi)的

8、功效。首先，對(duì)照白藜蘆醇，分別考察了何首烏中不同純度二苯乙烯苷樣品對(duì)小鼠心臟、肝臟、腦離體組織脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率。證實(shí)了二苯乙烯苷抑制脂質(zhì)過(guò)氧化能力明顯優(yōu)于白藜蘆醇。隨后建立D-半乳糖致衰小鼠模型(注射100mg/kg/dD-半乳糖42天)，選用2個(gè)劑量(20mg/kg/d；40mg/kg/d)分別以SG及RF-SG給小鼠灌胃，結(jié)果表明：給藥組小鼠的血清、肝臟、心臟、腦組織的MDA均低于模型組，SOD、GSH-Px均高于模型組；各項(xiàng)指標(biāo)

9、值接近正常組。充分體現(xiàn)了二苯乙烯苷的抗氧化之功效。 通過(guò)二苯乙烯苷與H2O2作用，分離純化得到四個(gè)主要氧化代謝產(chǎn)物，并通過(guò)LC-MS、NMR鑒定結(jié)構(gòu)，其中得率最高的主要產(chǎn)物為二聚體-二苯乙烯苷給出氫質(zhì)子，后自身聚合而成。由此產(chǎn)物結(jié)構(gòu)判定二苯乙烯苷抗氧化作用的反應(yīng)位點(diǎn)為苯環(huán)上C5-OH最活潑，易于給出H原子。其次兩個(gè)為二苯乙烯苷氧化雙鍵斷開的降解產(chǎn)物；另外一個(gè)為二苯乙烯苷被氧化為二聯(lián)苯。 運(yùn)用柱層析分離手段，純化DPPH自