何首烏二苯乙烯苷抑制長波紫外線誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷.pdf

1、目的：探討二苯乙烯苷對長波紫外線(UVA)照射HaCaT細胞氧化應激損傷的保護作用。方法從何首烏中提取二苯乙烯苷。UVA照射(18J/cm2)人角質形成細胞HaCaT構建體外細胞模型。MTT法測定細胞活力；酶生化法測定胞質SOD，GSH-px活性及MBA水平；人氧化應激與抗氧化PCR芯片檢測細胞內氧化應激及抗氧化相關基因mRNA的變化，并通過實時定量PCR驗證芯片結果。結果在18J/cm2UVA照射下，給定濃度范圍內的二苯乙烯苷能劑量依

2、賴性提高胞質SOD、GSH-px活力，降低胞質MBA水平；基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)二苯乙烯苷可明顯改變部分氧化應激及抗氧化基因的表達。通過實時定量PCR驗證，基因芯片結果真實、可靠。結論二苯乙烯苷對UVA輻射HaCaT細胞的氧化應激損傷具有一定的保護作用。其機制與清除自由基、提高抗氧化酶活性、改變相關基因表達有關。
　　 研究背景：
　　 自古以來，有關文獻記載的用作延緩衰老的中藥
　　 較多，如靈芝、人參、何首烏、綠茶

3、、銀杏等，已廣泛用于對抗機體衰老。但人們對這些藥物在延緩衰老方面的認識多基于宮廷秘方、古書所傳而做出的推論和假設，科學依據不足。部分研究發(fā)現(xiàn)，其功能可能主要基于多種生物活性成分，如多糖、黃酮、微量元素、維生素、植物激素等，這些成分具有促進細胞增殖，參與DNA和蛋白質合成與代謝，及抗氧化等作用。
　　 何首烏是一味古老的中藥，我國把何首烏用于強身鍵體、延年益壽已有一千多年的歷史。國外研究發(fā)現(xiàn)何首烏具有抗炎活性[1]。近年來國內研究

4、發(fā)現(xiàn)，何首烏在抗衰老、增強機體免疫、抗菌、造血和改善心血管功能等方面有許多獨到之處，隨即引起人們的廣泛關注。何首烏中含有多種生物活性成分，如葸醌類、二苯乙烯類和磷脂類化合物等[2]。其中二苯乙烯苷具有抗衰老、降低膽固醇、提高免疫功能、防治動脈硬化及保肝等作用[3]。
　　 何首烏抗衰老作用的機制研究已經取得了一定的研究進展：體外實驗證明其具有抗氧化作用[4]，清除自由基[5]，修復損傷基因，增強機體免疫力，以及延緩細胞衰老的作用

5、[6]。亞急性衰老動物試驗證實何首烏具有抗氧化[7]，調節(jié)腦組織內抗氧化酶的表達[8]，以及抗衰老作用][9]。既往的研究表明二苯乙烯苷具有較強的體外抗氧化作用，本研究旨在通過體外實驗研究細胞抗氧化酶活性、脂質氧化水平及氧化應激相關基因表達，以闡明二苯乙烯苷對長波紫外線照射角質形成細胞的氧化應激損傷具保護作用，并探討其可能機制，為其進一步成為潛在的光保護成分并應用于光保護制劑提供一定的理論依據。
　　 研究目的：
　　

6、第一部分：通過形態(tài)學觀察、MTT法及酶生化法檢測，研究不同濃度的二苯乙烯苷對UVA誘導的角質形成細胞活力的影響。觀察二苯乙烯苷對UVA誘導的角質形成細胞氧化應激損傷的保護作用。
　　 第二部分：采用人氧化應激與抗氧化PCR芯片(RT2 ProfilerTM PCR Array)檢測二苯乙烯苷作用于UVA誘導的角質形成細胞后相關基因表達水平的變化，從基因水平分析二苯乙烯苷可能的抗光老化作用機理；并利用實時熒光定量PCR技術對芯片結

7、果進行定量驗證分析。
　　 研究方法：
　　 第一部分：培養(yǎng)HaCaT細胞(人永生化角質形成細胞)，取指數(shù)生長期細胞分為6組，即：空白對照組、UVA實驗對照組、UVA+1mmol/L TSG組、UVA+0.1mmol/L TSG組、UVA+0.01mmol/L TSG組、UVA+0.001mmol/L TSG組，每組4個復孔。UVA照射前12 h加入TSG孵育，照射前倒去培養(yǎng)基，PBS液沖洗三次，加入PBS液后UVA照射

8、，強度為18J/cm2。照射后細胞繼續(xù)用含有相應濃度TSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h。倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)的變化；并用四唑鹽比色試驗(MTT法)檢測細胞存活和生長情況。培養(yǎng)HaCaT細胞，取指數(shù)生長期細胞分為6組，即空白對照組、UVA實驗對照組、UVA+1mmol/L TSG組、UVA+0.1mmol/LTSG組、UVA+0.01mmol/L TSG組、UVA+0.001mol/L TSG組，每組3個復孔。UVA照射前12 h加入TSG孵育，

9、照射前倒去培養(yǎng)基，PBS液沖洗三次，加入PBS液后UVA照射，強度為18J/cm2。照射后細胞繼續(xù)用含有相應濃度TSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后通過酶生化學檢測，測定細胞內MDA含量和S01D、GSH-P X活性。
　　 第二部分：培養(yǎng)HaCaT細胞，取指數(shù)生長期細胞分為2組(三個重復)，即UVA實驗對照組、UVA+1mmol/L TSG組。UVA照射前12 h加入TSG孵育，照射前倒去培養(yǎng)基，PBS液沖洗三次，加入PBS液后UVA照

10、射，強度為18J/cm2。照射后細胞繼續(xù)用含有相應濃度TSG的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后進行檢測。收集細胞進行RNA抽提、純化、質量檢測，用人氧化應激與抗氧化PCR芯片，檢測2組細胞氧化應激相關基因的表達差異，以觀察二苯乙烯苷對UVA誘導的角質形成細胞相關基因表達水平的作用。根據芯片結果，選出2條表達差異較大且與皮膚氧化應激相關的基因，即基因GSR、TXNRD1，加之1條管家基因GAPDH作為校正基因，進行實時熒光定量PCR分析，對PCR芯片結

11、果給予驗證。
　　 研究結果：
　　 第一部分：倒置顯微鏡下觀察，UVA模型組細胞增殖速度明顯降低，培養(yǎng)液中碎片增多，少數(shù)細胞呈皺縮狀甚至胞體變小，胞質內有空泡形成，顆粒增多。UVA+二苯乙烯苷各濃度組，雖然與空白對照組相比也可見部分細胞碎片，少數(shù)胞質內有空泡形成，但與UVA實驗對照組相比明顯減少?？瞻讓φ战M僅有較少的細胞碎片，總體生長良好。MTT法檢測結果顯示，空白對照組OD值最高，與UVA實驗對照組相比P值＜0.05

12、，說明細胞存活率高于UVA實驗對照組。UVA+二苯乙烯苷各濃度組與空白對照組相比P值＞0.05，說明UVA+二苯乙烯苷各濃度組的細胞存活率與UVA實驗對照組相比雖有數(shù)值上的上升，但無統(tǒng)計學差異。
　　 與空白對照組相比，UVA實驗對照組的SOD、GSH-PX活性明顯降低(P值均＜0.05)，MDA含量顯著增高(P＜0.05)；UVA+二苯乙烯苷各濃度組的SOD、GSH-PX的活性降低，MDA含量則增高(P＜0.05)。而UVA+

13、二苯乙烯苷各濃度組與UVA實驗對照組相比，SOD、GSH-PX活性升高(P＜0.05)，MDA含量減少(P＜0.05)。
　　 第二部分：最有效濃度的二苯乙烯苷(1mmol/L)作用于UVA誘導的HaCaT細胞，在所檢測的89條人類氧化應激與抗氧化相關基因中，共有17條基因熒光信號強度ratio值變化在2倍以上，為差異表達基因。其中16條基因的(干預組/對照組)ratio值＞2，為上調基因；而1條基因的(干預組/對照組)rati

14、o值＜0.5，為下調基因。依芯片結果選出2條表達差異較大且與皮膚氧化應激相關的基因GSR、TXNRD1。通過實時熒光定量PCR方法檢測干預組與對照組的2條基因(三組重復)，實時熒光定量PCR結果與基因芯片方法檢測結果的總體趨勢一致。
　　 結論：
　　 第一部分：二苯乙烯苷對于UVA照射HaCaT細胞的生長有一定促進作用，但對細胞存活率影響不大。二苯乙烯苷對SOD、GSH-PX抗氧化酶的活性有一定增加作用；同時對抗UVA

15、誘導的脂質過氧化作用，從而減少細胞的MDA含量。故其能保護細胞免受UVA誘導的氧化應激損傷。
　　 第二部分：二苯乙烯苷通過影響氧化應激相關基因的表達，特別是上調了ALOX12、ANGPTL7、AOX1、APOE、CSDE1、GLRX2、GSR、NOS2A、OXR1、PRDX3、PRNP、SCARA3、SEPP1、SFTPD、TTN、TXNRD1抗氧化基因的表達，從而增強細胞的抗氧化能力，起到對細胞的保護作用。RT-PCR方法對