高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)老齡小鼠突觸可塑性相關(guān)基因的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:隨著科學(xué)、經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,老齡化趨勢(shì)越來(lái)越明顯,老齡化及增齡性相關(guān)腦疾病不但給個(gè)人和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),同時(shí)也是影響社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的巨大障礙。因而對(duì)于改善認(rèn)知功能、延緩腦腦化、防止增齡性腦疾病的研究具有重要意義。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(Repetitivetranscranialmagneticstimulation,rTMS)是一種安全、無(wú)創(chuàng)、價(jià)廉的顱外刺激方法,越來(lái)越廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)及精神病學(xué)領(lǐng)域的各個(gè)方面。研究表明,某種特定參

2、數(shù)的rTMS對(duì)腦組織的刺激可以誘導(dǎo)神經(jīng)元活性改變及持續(xù)的提高海馬神經(jīng)元興奮性,進(jìn)而影響突觸可塑性,如長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Longtermpotentiation,LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(Longtermdepression,LTD),從而發(fā)揮調(diào)節(jié)腦功能的作用。同時(shí),在LTP/LTD形成過(guò)程中,會(huì)誘導(dǎo)表達(dá)許多突觸可塑性相關(guān)基因,比如即刻早期基因(Immediateearlygenes,IEGs)及LTP/LTD相關(guān)基因。但是,目前rTMS誘導(dǎo)突觸可

3、塑性的確切分子機(jī)制及對(duì)老齡腦神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究通過(guò)應(yīng)用水迷宮及PCRarray技術(shù),旨在明確不同rTMS刺激模式對(duì)老齡腦神經(jīng)元活性及基因表達(dá)的影響,并從mRNA水平迸一步探討其分子機(jī)制及與認(rèn)知功能的潛在關(guān)系,為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的依據(jù)。
   方法:(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:老齡昆明小鼠(15月齡)40只。(2)實(shí)驗(yàn)方法:①重復(fù)經(jīng)顱磁刺激:40只老齡昆明小鼠根據(jù)認(rèn)知水平分為三組,使三組間認(rèn)知水平平行,對(duì)照組即假刺激組

4、14只,5Hz30%強(qiáng)度組13只,5Hz20%強(qiáng)度組13只。刺激方式:磁刺激組刺激強(qiáng)度分別為30%及20%最大輸出強(qiáng)度,刺激頻率為5Hz,每天磁刺激1000脈沖;假刺激組用磁頭的反面進(jìn)行刺激。連續(xù)刺激2周。②Morris水迷宮實(shí)驗(yàn):磁刺激后第1天開(kāi)始,分別記錄每只小鼠尋找平臺(tái)潛伏期,連續(xù)進(jìn)行5天,第6天記錄其穿越原平臺(tái)所在象限的次數(shù)。③海馬RNA提取:水迷宮試驗(yàn)后也就是rTMS后第七天將小鼠處死,快速取出海馬組織凍存于-80度冰箱。使用

5、RNeasyMiniKit試劑盒提取凍存的海馬RNA。④海馬RNA逆轉(zhuǎn)錄:每組取1μgRNA使用RT2FirstStrandKit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。⑤PCRarray反應(yīng):使用96孔板MouseSynapticPlasticityRT2ProfilerPCRArray分析rTMS后突觸可塑性相關(guān)基因的表達(dá),96孔板包括84個(gè)突觸可塑性相關(guān)基因,5個(gè)管家基因及7個(gè)質(zhì)量控制基因(GDC×1,RTC×3,PPC×3)。并使用SABi

6、osciencesPCRArray數(shù)據(jù)分析Excel模板對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。⑥Morris水迷宮采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理,分別采用重復(fù)測(cè)量方差分析和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P<0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。
   結(jié)果:(1)rTMS對(duì)老齡昆明小鼠視空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響:Moms水迷宮結(jié)果顯示,5Hz20%及30%強(qiáng)度磁刺激組尋臺(tái)潛伏期均較假刺激組縮短(

7、P<0.05),說(shuō)明rTMS可以顯著改善老齡昆明小鼠的視空間學(xué)習(xí)記憶能力。此外,5Hz30%強(qiáng)度組(P<O.01)較5Hz20%強(qiáng)度組(P<0.05)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義更顯著。兩個(gè)磁刺激組穿越平臺(tái)次數(shù)均較假刺激組顯著增多(P<0.05)。同樣,5Hz30%強(qiáng)度組(P<0.01)較5Hz20%強(qiáng)度組(P<0.05)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義更顯著。(2)rTMS對(duì)老齡昆明小鼠突觸可塑性相關(guān)基因的影響:根據(jù)功能將84個(gè)突觸可塑性相關(guān)基因分為十類,包括:IEGs,L

8、TP,LTD,細(xì)胞粘附(CellAdhesion)、CREB反應(yīng)元件(CREBCofactors)、細(xì)胞外基質(zhì)及蛋白降解相關(guān)(ExtracellularMatrix&ProteolyticProcessing,EMPP)、神經(jīng)元受體(NeuronalReceptors,NR)、突觸后致密物(PostsynapticDensity,PD)、晚反應(yīng)基因(LateResponseGenes)及其他與突觸重塑相關(guān)的基因。根據(jù)基因變化情況,我們選

9、擇的上調(diào)標(biāo)準(zhǔn)為1.5倍,下調(diào)標(biāo)準(zhǔn)為2倍作為有意義基因。與假刺激組相比,5Hz30%強(qiáng)度組10個(gè)基因至少上調(diào)1.5倍,13個(gè)基因至少下調(diào)2倍,5Hz20%強(qiáng)度組上調(diào)1.5倍及以上的基因?yàn)?個(gè),下調(diào)2倍及以上的基因?yàn)?5個(gè),且最大上調(diào)及最大下調(diào)基因均在5Hz30%強(qiáng)度組。其中,引起我們關(guān)注的有5Hz30%強(qiáng)度組Junb、Grip1、Camk2g基因表達(dá)分別上調(diào)11.41、2.73倍,Inhba基因表達(dá)下調(diào)3.45倍;5Hz20%強(qiáng)度組Jun

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