高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對老齡小鼠突觸可塑性相關(guān)基因的影響.pdf

1、目的:隨著科學、經(jīng)濟的不斷發(fā)展,老齡化趨勢越來越明顯,老齡化及增齡性相關(guān)腦疾病不但給個人和家庭帶來巨大的經(jīng)濟負擔,同時也是影響社會經(jīng)濟發(fā)展的巨大障礙。因而對于改善認知功能、延緩腦腦化、防止增齡性腦疾病的研究具有重要意義。重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(Repetitivetranscranialmagneticstimulation,rTMS)是一種安全、無創(chuàng)、價廉的顱外刺激方法,越來越廣泛的應(yīng)用于神經(jīng)科學及精神病學領(lǐng)域的各個方面。研究表明,某種特定參

2、數(shù)的rTMS對腦組織的刺激可以誘導神經(jīng)元活性改變及持續(xù)的提高海馬神經(jīng)元興奮性,進而影響突觸可塑性,如長時程增強(Longtermpotentiation,LTP)和長時程抑制(Longtermdepression,LTD),從而發(fā)揮調(diào)節(jié)腦功能的作用。同時,在LTP/LTD形成過程中,會誘導表達許多突觸可塑性相關(guān)基因,比如即刻早期基因(Immediateearlygenes,IEGs)及LTP/LTD相關(guān)基因。但是,目前rTMS誘導突觸可

3、塑性的確切分子機制及對老齡腦神經(jīng)元的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究通過應(yīng)用水迷宮及PCRarray技術(shù),旨在明確不同rTMS刺激模式對老齡腦神經(jīng)元活性及基因表達的影響,并從mRNA水平迸一步探討其分子機制及與認知功能的潛在關(guān)系,為神經(jīng)退行性疾病的治療提供新的依據(jù)。
　　 方法:(1)實驗動物:老齡昆明小鼠(15月齡)40只。(2)實驗方法:①重復(fù)經(jīng)顱磁刺激:40只老齡昆明小鼠根據(jù)認知水平分為三組,使三組間認知水平平行,對照組即假刺激組

4、14只,5Hz30％強度組13只,5Hz20％強度組13只。刺激方式:磁刺激組刺激強度分別為30％及20％最大輸出強度,刺激頻率為5Hz,每天磁刺激1000脈沖;假刺激組用磁頭的反面進行刺激。連續(xù)刺激2周。②Morris水迷宮實驗:磁刺激后第1天開始,分別記錄每只小鼠尋找平臺潛伏期,連續(xù)進行5天,第6天記錄其穿越原平臺所在象限的次數(shù)。③海馬RNA提取:水迷宮試驗后也就是rTMS后第七天將小鼠處死,快速取出海馬組織凍存于-80度冰箱。使用

5、RNeasyMiniKit試劑盒提取凍存的海馬RNA。④海馬RNA逆轉(zhuǎn)錄:每組取1μgRNA使用RT2FirstStrandKit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA。⑤PCRarray反應(yīng):使用96孔板MouseSynapticPlasticityRT2ProfilerPCRArray分析rTMS后突觸可塑性相關(guān)基因的表達,96孔板包括84個突觸可塑性相關(guān)基因,5個管家基因及7個質(zhì)量控制基因(GDC×1,RTC×3,PPC×3)。并使用SABi

6、osciencesPCRArray數(shù)據(jù)分析Excel模板對結(jié)果進行分析。⑥Morris水迷宮采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理,分別采用重復(fù)測量方差分析和單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,統(tǒng)計結(jié)果以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的標準。
　　 結(jié)果:(1)rTMS對老齡昆明小鼠視空間學習記憶能力的影響:Moms水迷宮結(jié)果顯示,5Hz20％及30％強度磁刺激組尋臺潛伏期均較假刺激組縮短(

7、P＜0.05),說明rTMS可以顯著改善老齡昆明小鼠的視空間學習記憶能力。此外,5Hz30％強度組(P＜O.01)較5Hz20％強度組(P＜0.05)統(tǒng)計學意義更顯著。兩個磁刺激組穿越平臺次數(shù)均較假刺激組顯著增多(P＜0.05)。同樣,5Hz30％強度組(P＜0.01)較5Hz20％強度組(P＜0.05)統(tǒng)計學意義更顯著。(2)rTMS對老齡昆明小鼠突觸可塑性相關(guān)基因的影響:根據(jù)功能將84個突觸可塑性相關(guān)基因分為十類,包括:IEGs,L

8、TP,LTD,細胞粘附(CellAdhesion)、CREB反應(yīng)元件(CREBCofactors)、細胞外基質(zhì)及蛋白降解相關(guān)(ExtracellularMatrix&ProteolyticProcessing,EMPP)、神經(jīng)元受體(NeuronalReceptors,NR)、突觸后致密物(PostsynapticDensity,PD)、晚反應(yīng)基因(LateResponseGenes)及其他與突觸重塑相關(guān)的基因。根據(jù)基因變化情況,我們選

9、擇的上調(diào)標準為1.5倍,下調(diào)標準為2倍作為有意義基因。與假刺激組相比,5Hz30％強度組10個基因至少上調(diào)1.5倍,13個基因至少下調(diào)2倍,5Hz20％強度組上調(diào)1.5倍及以上的基因為9個,下調(diào)2倍及以上的基因為25個,且最大上調(diào)及最大下調(diào)基因均在5Hz30％強度組。其中,引起我們關(guān)注的有5Hz30％強度組Junb、Grip1、Camk2g基因表達分別上調(diào)11.41、2.73倍,Inhba基因表達下調(diào)3.45倍;5Hz20％強度組Jun