CS2致男(雄)性下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂機制初探及NO的干預作用.pdf

1、目前，有關(guān)CS2對男（雄）性HPGA影響的研究鮮有報道，其具體的分子調(diào)控機制尚不清楚。本項目以CS2為受試物，以HPGA為研究對象，將職業(yè)人群調(diào)查、整體動物實驗和體外細胞培養(yǎng)相結(jié)合，探討CS2對男（雄）性HPGA功能的影響及其機制，并探討NO供體硝普鈉（Sodium Nitroprusside，SNP）和總NOS抑制劑N-甲基-L-精氨酸（NG-Monomethyl-L-arginine，L-NMMA）的干預作用，為進一步闡明NO對生殖

2、內(nèi)分泌的作用，豐富對CS2致男（雄）性生殖損傷分子機制的認識提供科學依據(jù)。
　　 第一部分、CS2職業(yè)接觸人群調(diào)查研究
　　 一、CS2職業(yè)暴露對男工性功能和生殖結(jié)局的影響
　　 目的：探討CS2對接觸男工性功能及生殖結(jié)局的影響。
　　 方法：對276名CS2暴露男工和126名非CS2暴露男工的基本情況、性功能及其配偶生殖結(jié)局進行調(diào)查研究。
　　 結(jié)果：性功能調(diào)查結(jié)果顯示，CS2暴露組男工性生活和

3、諧比例及性生活頻度降低，性生活厭惡感增加（P＜0.05）；各組間男工妻子妊娠并發(fā)癥發(fā)生率無統(tǒng)計學差異（P> 0.05）。生殖結(jié)局調(diào)查結(jié)果表明，混合組（夫妻雙方均接觸CS2）的自然流產(chǎn)率與單純組（只有男工接觸CS2而其妻子不接觸）和對照組比較均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；混合組與對照組比較，子代低出生體重發(fā)生比例增高（P＜0.05），子代智力發(fā)育及生長發(fā)育無統(tǒng)計學差異（P> 0.05）。
　　 結(jié)論：CS2職業(yè)暴露可導致男性性

4、功能障礙和不良生殖結(jié)局，但對子代的智力和生長發(fā)育影響不明顯。
　　 二、CS2職業(yè)暴露對男工血清性激素水平的影響
　　 目的：探討CS2對職業(yè)接觸男工血清性激素水平的影響。
　　 方法：選擇工齡、文化程度、生活條件等基本情況相似的CS2暴露男工63名和非CS2暴露男工69名，對其血清GnRH、FSH、LH和T水平進行檢測。
　　 結(jié)果：工齡2～8年的CS2暴露組男工，血清T和LH水平明顯高于對照組（P＜0

5、.05）；工齡8年以上的CS2暴露組男工，血清T、FSH、GnRH水平明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。
　　 結(jié)論：職業(yè)接觸CS2可導致男性生殖內(nèi)分泌功能紊亂，血清LH水平首先發(fā)生改變，可作為反映CS2生殖損傷的早期指標。
　　 第二部分、CS2對大鼠下丘腦-垂體-性腺軸超微病理結(jié)構(gòu)的影響以及NO的干預作用
　　 目的：探討CS2對雄性大鼠下丘腦-垂體-性腺軸超微病理結(jié)構(gòu)的影響及NO的干預作用。<

6、br>　　 方法：36只雄性SD大鼠隨機分為6組，以不同濃度CS2（0、50、250、1250 mg/m3）靜式吸入染毒，共10周，另設(shè)CS2（1250 mg/m3）+SNP（5mg/kg）和CS2（1250 mg/m3）+L-NMMA（2mg/kg）干預組，SNP和L-NMMA從動物染毒結(jié)束前10 d開始腹腔注射，1次/d。染毒結(jié)束后，采用透射電鏡觀察大鼠下丘腦、垂體和睪丸組織超微病理結(jié)構(gòu)的改變。
　　 結(jié)果：CS2染毒可造

7、成下丘腦神經(jīng)元、垂體促性腺激素細胞、生長激素細胞和睪丸支持細胞線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，NO供體對CS2引起的下丘腦、垂體、睪丸組織的損傷具有拮抗作用，而NOS抑制劑則進一步導致病變的發(fā)生。
　　 結(jié)論：CS2可造成下丘腦、垂體和睪丸組織超微病理結(jié)構(gòu)的改變，NO在這過程中發(fā)揮重要作用。
　　 第三部分、大鼠下丘腦神經(jīng)元和垂體前葉細胞體外培養(yǎng)方法的建立
　　 一、新生大鼠下丘腦神經(jīng)元原代培養(yǎng)和鑒定
　　 目的

8、：探討大鼠下丘腦神經(jīng)元體外培養(yǎng)技術(shù)。
　　 方法：選用新生SD大鼠，取下丘腦組織進行單細胞原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)細胞在體外生長的情況，并采用尼氏染色法對體外培養(yǎng)的神經(jīng)元進行鑒定。
　　 結(jié)果：培養(yǎng)3 d時觀察發(fā)現(xiàn)下丘腦神經(jīng)元具有雙極突起，突起較短；培養(yǎng)7 d時神經(jīng)元突起長度達到最高峰；尼氏染色可見胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀的尼氏體，呈深藍色。
　　 結(jié)論：本實驗室采用的大鼠下丘腦神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法能夠為開展神經(jīng)內(nèi)

9、分泌的分子生物學研究提供理想的體外實驗模型。
　　 二、大鼠垂體前葉細胞體外培養(yǎng)和鑒定
　　 目的：探討大鼠垂體前葉細胞體外培養(yǎng)技術(shù)。
　　 方法：選用成年雄性SD大鼠，取垂體前葉進行單細胞原代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)細胞在體外生長的情況，并采用免疫細胞化學染色技術(shù)對垂體前葉細胞LH和FSH分泌細胞進行鑒定。
　　 結(jié)果：垂體前葉細胞呈圓形，折光性較強，成纖維細胞生長明顯，原代培養(yǎng)后期成纖維細胞已為

10、主要細胞。免疫細胞化學染色結(jié)果顯示，LH和FSH免疫陽性細胞胞漿呈棕黃色。
　　 結(jié)論：體外培養(yǎng)的垂體細胞中有多種細胞的生長，反復差速貼壁法能較好的去除成纖維細胞，提高垂體前葉細胞的純度，但LH和FSH免疫反應(yīng)陽性細胞比例較低。
　　 第四部分、CS2致雄性大鼠下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂機制的研究
　　 一、CS2對大鼠下丘腦-垂體-性腺軸激素和激素受體mRNA表達水平的影響以及NO的干預作用
　　 目

11、的：探討CS2對大鼠下丘腦-垂體-性腺軸激素和激素受體mRNA表達水平的影響以及NO的干預作用
　　 方法：對體外培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細胞進行染毒，共設(shè)6個染毒組，分別為對照組、3個不同濃度CS2染毒組（2.5、5.0、10.0 mmol/ml CS2）、SNP干預組（10.0 mmol/ml CS2+20 mmol/ml SNP）和L-NMMA干預組（10.0 mmol/ml CS2+50 mmol/ml L-NMMA），支持細

12、胞的6個染毒組分別為對照組、3個不同濃度CS2染毒組（1.25、2.50、5.00 mmol/ml CS2）、SNP干預組（5.00 mmol/ml CS2+10 mmol/ml SNP）和L-NMMA干預組（5.00 mmol/ml CS2+25mmol/ml L-NMMA），采用Real-time PCR對垂體前葉細胞中GnRHR mRNA和睪丸支持細胞中FSHR、ABP、INH mRNA表達水平進行檢測。
　　 結(jié)果：垂體

13、前葉細胞中GnRHR mRNA表達水平在10.0 mmol/ml CS2染毒時顯著降低（P＜0.05），NOS抑制劑L-NMMA可拮抗CS2的作用，使GnRHR mRNA表達水平顯著增高（P＜0.05）；在睪丸支持細胞中，不同濃度CS2染毒組與對照組比較，ABP和INHαmRNA表達水平?jīng)]有明顯變化（P> 0.05），5.0 mmol/ml CS2染毒組FSHR和INHβb mRNA表達水平顯著降低，INHβa mRNA表達水平顯著增高

14、（P＜0.05）；NO供體SNP干預組與5.0 mmol/ml CS2染毒組比較，INHαmRNA表達水平顯著增高（P＜0.05），ABP、FSHR、INHβa和INHβb mRNA表達水平改變均不明顯（P> 0.05）；NOS抑制劑L-NMMA干預組與5.0 mmol/ml CS2染毒組比較，ABP mRNA表達水平顯著增高（P＜0.05），F(xiàn)SHR、INHα、INHβa和INHβb mRNA表達水平改變均不明顯（P> 0.05）。<

15、br>　　 結(jié)論：CS2可抑制垂體前葉細胞中GnRHR、支持細胞中FSHR和INHβb的表達，通過抑制HPGA中多種激素和激素受體的合成，導致HPGA功能紊亂，CS2對垂體GnRHR的抑制作用與NOS活性有關(guān)。
　　 二、CS2對大鼠下丘腦神經(jīng)元、垂體前葉細胞和睪丸支持細胞內(nèi)cAMP/cGMP的影響以及NO的干預作用
　　 目的：探討CS2對大鼠下丘腦神經(jīng)元、垂體前葉細胞和睪丸支持細胞內(nèi)cAMP/cGMP的影響以及NO

16、的干預作用。
　　 方法：對體外培養(yǎng)的大鼠下丘腦神經(jīng)元和垂體前葉細胞進行染毒，共設(shè)6個染毒組，分別為對照組、3個不同濃度CS2染毒組、SNP干預組和L-NMMA干預組，支持細胞的6個染毒組分別為對照組、3個不同濃度CS2染毒組（1.25、2.50、5.00 mmol/ml CS2）、SNP干預組（5.00 mmol/ml CS2+10 mmol/ml SNP）和L-NMMA干預組（5.00 mmol/ml CS2+25mmol/

17、ml L-NMMA），采用酶聯(lián)免疫吸附試驗對下丘腦神經(jīng)元、垂體前葉細胞和睪丸支持細胞中cAMP和cGMP水平進行檢測。
　　 結(jié)果：下丘腦神經(jīng)元中，各染毒組cAMP水平變化不明顯（P> 0.05），cGMP水平在10.0 mmol/ml CS2染毒組顯著降低，SNP可拮抗CS2的作用，使cGMP水平顯著增高（P＜0.05）；垂體前葉細胞中cAMP和cGMP水平不隨CS2染毒濃度的增加而發(fā)生改變（P> 0.05），但L-NMMA干