下丘腦垂體腎上腺軸反應(yīng)對(duì)骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員作用與分子機(jī)制.pdf

1、全球范圍內(nèi)由創(chuàng)傷引起的死亡人數(shù)持續(xù)升高，預(yù)計(jì)到2020年會(huì)達(dá)到840萬(wàn)，而嚴(yán)重組織損傷是致死致殘的關(guān)鍵因素，因此尋找早期有效修復(fù)損傷組織、預(yù)防和控制創(chuàng)傷并發(fā)癥的治療方法是提高嚴(yán)重創(chuàng)傷患者生存率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。近年來(lái)，成體干細(xì)胞為嚴(yán)重?fù)p傷組織的修復(fù)帶來(lái)新的曙光。在成年個(gè)體中，定植于骨髓中的干細(xì)胞可以動(dòng)員并向損傷組織遷移，作為種子細(xì)胞直接參與損傷組織的修復(fù)。此外，成體干細(xì)胞還具有免疫調(diào)節(jié)作用，如間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal ste

2、m cells，MSCs)可以抑制T、B、NK細(xì)胞的增殖和B細(xì)胞的遷移；抑制TH1細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子，促進(jìn)TH2細(xì)胞產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子等。雖然外源性干細(xì)胞移植在損傷組織治療中具有重要價(jià)值，然而這種方法還有諸多倫理和技術(shù)瓶頸需要面對(duì)，如干細(xì)胞體外擴(kuò)增、鑒定及其在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸等等。損傷組織修復(fù)需要骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員，并作為種子細(xì)胞遷移到損傷部位。但是目前臨床上所用的干細(xì)胞動(dòng)員劑具有很多副作用，近30%的病人會(huì)出現(xiàn)骨痛、頭痛、四肢乏力等癥狀，嚴(yán)重

3、者甚至發(fā)生急性肺損傷，部分伴有基礎(chǔ)疾患的創(chuàng)傷患者對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員劑不敏感。因此，探索內(nèi)源性干細(xì)胞動(dòng)員機(jī)制具有重要科學(xué)意義和臨床價(jià)值。
　　 近年發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)對(duì)骨髓干細(xì)胞動(dòng)員、增殖、分化和修復(fù)功能有潛在調(diào)控作用，如交感腎上腺髓質(zhì)和其他內(nèi)分泌器官源性激素(如去甲腎上腺素、雌激素)可以促進(jìn)不同類(lèi)型骨髓干細(xì)胞從骨髓池外流。鑒于神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)對(duì)于骨髓干細(xì)胞數(shù)量的影響，以及效應(yīng)激素在損傷微環(huán)境中的重要作用，我們推測(cè)下丘腦-垂體-腎上腺(

4、hypothalamus-pituitary-adrenal，HPA)軸激活可能是下丘腦-骨髓-外周血三位一體的干細(xì)胞動(dòng)員策略的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，本研究以HPA軸及其關(guān)鍵效應(yīng)激素-糖皮質(zhì)激素為切入點(diǎn)，探討其對(duì)骨髓干細(xì)胞(HSCs、MSCs、EPCs)動(dòng)員的影響及作用機(jī)制，進(jìn)而初步探討神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)對(duì)骨髓干細(xì)胞的動(dòng)員及后續(xù)損傷組織修復(fù)和再生的影響，旨在從骨髓干細(xì)胞動(dòng)員角度為損傷組織修復(fù)另辟蹊徑，從而更好地促進(jìn)損傷組織實(shí)現(xiàn)功能修復(fù)。
　

5、　 方法：繁育并鑒定CRH野生型(CRH+/+)小鼠和CRH基因敲除(CRH－/－)小鼠；將CRH野生型(CRH+/+)小鼠和CRH基因敲除(CRH-/-)小鼠分為強(qiáng)迫跑步應(yīng)激組和對(duì)照組。應(yīng)激后1h，通過(guò)摘眼球取血法獲取足量抗凝血。ELISA法測(cè)定血漿皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)濃度。外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)和造血干細(xì)胞(HSCs)的數(shù)量通過(guò)流式細(xì)胞分析法確定；利用微量注射泵對(duì)CRH+

6、/+和CRH-/-小鼠分別輸注不同劑量的糖皮質(zhì)激素，以上述方法分別檢測(cè)小鼠血漿皮質(zhì)酮濃度，及其與外周血EPCs、MSCs和HSCs數(shù)量變化的關(guān)系；分離培養(yǎng)骨髓MSCs和EPCs，用糖皮質(zhì)受體阻斷劑RU486(10μM)預(yù)處理30 min，通過(guò)neuro probe趨化小室法觀察不同濃度(0ng/ml、75ng/ml、100 ng/ml、1500 ng/ml)的糖皮質(zhì)激素對(duì)MSC、EPC趨化功能的影響及其趨化受體fMLP-R表達(dá)變化。

7、r>　　 結(jié)果：1.跑步應(yīng)激后CRH+/+小鼠血漿皮質(zhì)酮水平明顯升高，同時(shí)其外周血MSCs、EPCs的數(shù)量也顯著增加；但CRH-/-小鼠血漿皮質(zhì)酮水平在跑步應(yīng)激后沒(méi)有明顯變化，同時(shí)其外周血MSCs和EPCs的數(shù)量減少；2.給CRH+/+和CRH-/-小鼠注射糖皮質(zhì)激素后，其血漿皮質(zhì)酮水平都顯著增加，同時(shí)外周血HSCs、MSCs、EPCs的數(shù)量也顯著升高：3.低濃度皮質(zhì)酮可以促進(jìn)骨髓MSCs、EPCs向fMLP的趨化運(yùn)動(dòng)；RU486預(yù)處

8、理可以逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素對(duì)MSCs和EPCs趨化功能的影響；4.不同濃度的糖皮質(zhì)激素均可以促進(jìn)骨髓MSCs、EPCs fMLP-R mRNA表達(dá)，且低濃度的糖皮質(zhì)激素可以促進(jìn)fMLP-R蛋白的表達(dá)，這種作用可被RU486逆轉(zhuǎn)。
　　 結(jié)論：1.急性應(yīng)激條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)生顯著的動(dòng)員反應(yīng)，HPA軸反應(yīng)及其關(guān)鍵效應(yīng)激素-糖皮質(zhì)激素發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)效應(yīng)；2.在干細(xì)胞動(dòng)員中，糖皮質(zhì)激素可通過(guò)上調(diào)fMLP-R，經(jīng)糖皮質(zhì)激素受體基