α螺旋抗菌肽與α防御素4抗病原微生物活性及作用機制研究.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)作為廣譜抗菌、抗病毒且不易引起耐藥的小分子多肽藥物受到廣泛重視，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、材料等領(lǐng)域開展了大量應(yīng)用研究?，F(xiàn)階段我國養(yǎng)豬業(yè)面臨著耐藥菌株不斷出現(xiàn)、病毒病流行等困擾，研究可抑制病原復(fù)制的新型制劑，具有重要現(xiàn)實意義。因此本研究選取α螺旋抗菌肽cecropin B，moricin，piscidin，caerin, maculatin和其它結(jié)構(gòu)的lactoferricin B，i

2、ndolicidin作為代表，研究其對豬場常見病原的抑制活性及作用機制。進而以HNP4作為代表性多肽，研究其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系，為進一步解析其作用機理奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　一、cecropin B和moricin對豬場常見病原菌的抗菌活性及作用機制研究
　　1、篩選具有抗菌效果的抗菌肽通過對副豬嗜血桿菌、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌和豬鏈球菌等八種豬場常見細菌的抗菌活性研究，發(fā)現(xiàn)moricin對所有病原菌均具有抑制作用，

3、而cecropinB對革蘭氏陰性菌有更強烈抑制作用。通過殺菌曲線發(fā)現(xiàn)二者能夠在短時間內(nèi)殺滅所有細菌。
　　2、細菌疏水性、電荷性與對cecropin B敏感性之間的關(guān)系測試了cecropin B對副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及部分臨床菌株的抑制作用，發(fā)現(xiàn)均具有較好的活性(MIC為2μg/ml-16μg/ml)。通過十六烷吸附試驗和電泳試驗研究了不同菌株膜表面的疏水性和電荷性，與其對cecropinB的敏感性之間建立關(guān)系，發(fā)現(xiàn)疏水性越強和帶

4、負電荷越多的菌株對cecropinB越敏感。
　　3、抗菌肽cecropin B引起副豬嗜血桿菌形態(tài)學(xué)變化的觀察利用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)等手段觀察細菌形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)cecropinB能夠損壞細菌膜導(dǎo)致質(zhì)膜分離、內(nèi)容物外泄和中空細胞等現(xiàn)象。同時可以觀察到致密電子點形成等細菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)改變。表明抗菌肽能作用于細菌膜結(jié)構(gòu)，同時也有可能作用于細菌內(nèi)靶位點。研究結(jié)果表明cecropinB可

5、作為候選的抗革蘭氏陰性菌藥物開發(fā)。
　　二、抗菌肽對豬源病毒的抑制活性和作用機制研究
　　1、抗病毒多肽的篩選由于moricin和cecropinB對病毒抑制作用不明顯，根據(jù)報道重新選取了五種不同來源的抗菌肽piscidin，maculatin，caerin，lactoferricin B，indolicidin對偽狂犬病毒(PRV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、傳染性胃腸炎病毒(TG

6、EV)和輪狀病毒(RV)進行抗病毒活性研究。TCID50測定piscidin，maculatin，caerin對大部分病毒抑制作用較強，抗病毒活性與其濃度呈正比。piscidin和caerin處理PRV后的病毒存活率僅為2％，作用最強，并可抑制不同偽狂犬病毒毒株。
　　2、抗菌肽對PRV復(fù)制過程的抑制研究通過病毒感染前多肽處理細胞、病毒感染后多肽處理細胞以及多肽直接處理病毒粒子三種方式，研究抗菌肽對病毒復(fù)制階段的影響。發(fā)現(xiàn)macu

7、latin，caerin和piscidin均直接作用于病毒粒子。通過非線性回歸分析計算IC50，表明多肽對PRV的抑制活性從高到低為:piscidin＞ maculatin＞caerin。細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)抗菌肽能夠顯著抑制病毒引起的細胞凋亡。
　　3、用小鼠作為模型，測定piscidin抗PRV感染的能力通過小鼠試驗，發(fā)現(xiàn)piscidin在低至2.5μg/ml濃度時仍能殺滅PRV，對小鼠提供90％的保護，并且在大于5μg/ml濃度

8、時就能夠完全保護小鼠免受PRV致死性感染。這表明piscidin可以作為抗病毒藥物進行開發(fā)。
　　三、HNP4的結(jié)構(gòu)-功能活性研究
　　1、氨基酸和結(jié)構(gòu)改變對HNP4抑菌活性的影響首先合成、純化出高質(zhì)量HNP4及突變體，通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)HNP4對E.coli的抑制活性強于對S.aureus的抑制作用。所有HNP4精氨酸突變體對E.coli和S.aureus的活性均比HNP4低很多。但是對HNP4影響最大的是位于26位的苯丙氨

9、酸。其相對應(yīng)的突變體F26A-HNP4對S.aureus的抑制作用幾乎完全喪失，但對E.colli的抑制作用沒有影響。二聚對HNP4抗革蘭氏陰性菌活性影響不大，但其革蘭氏陽性菌抑制活性下降約3倍。因此HNP4很有可能是采取兩種不同的機制來抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。
　　2、氨基酸和結(jié)構(gòu)改變對HNP4抑制炭疽桿菌致死因子(LF)活性和結(jié)合gp120活性的影響通過非線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)同抑菌試驗結(jié)果類似，26位的苯丙氨酸對HNP4

10、的活性影響最大，精氨酸次之。HNP4的單體MeLeu20-HNP4對LF和gp120結(jié)合能力也明顯下降。上述研究結(jié)果表明對HNP4功能影響最大的是26位苯丙氨酸，其次是精氨酸。二聚也會影響HNP4的部分功能。
　　總之，本研究發(fā)現(xiàn)了能抑制副豬嗜血桿菌和偽狂犬病毒的抗菌肽cecropinB和piscidin。同時通過HNP4結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)了對HNP4功能活性影響最大的苯丙氨酸和精氨酸，獲得了研究抗菌肽結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的技術(shù)方