人α防御素5的基因工程制備及其抗幾種病原微生物的活性研究.pdf

1、當(dāng)前臨床上出現(xiàn)了大量針對傳統(tǒng)抗生素的耐藥細(xì)菌株和一些強(qiáng)致病性病毒毒株，人類健康常常受到病原微生物的威脅。面對感染防治的嚴(yán)峻形勢，我們不得不努力尋找新型的抗感染物質(zhì)。 經(jīng)過近二十年的研究，發(fā)現(xiàn)在植物、昆蟲和包括人在內(nèi)的高等動物機(jī)體內(nèi)存在近千種內(nèi)源性陽離子肽-防御素(Defensin)。具有活性的防御素分子一般為3～6kD，多數(shù)分子內(nèi)存在6～8個保守半胱氨酸殘基形成的3～4對鏈內(nèi)二硫鍵外，還富含精氨酸、脯氨酸等特殊殘基，整個分子在中

2、性溶液中帶正電荷；晶體衍射揭示防御素分子具有α螺旋、β折疊、二硫鍵橋、無規(guī)卷曲等單種或多種二級結(jié)構(gòu)所形成的單體或多聚體空間結(jié)構(gòu)。根據(jù)二硫鍵等結(jié)構(gòu)的組成方式，防御素被分為α、β和θ等類型。研究已證實(shí)，有805種防御素不僅具有快速、強(qiáng)效地殺滅多種細(xì)菌的活性，并且還具有不誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株的特性；有261種防御素具有抗白色念珠菌等真菌和螺旋體的作用；有48種防御素具有抗HIV、HPV和或HSV等病毒的效果；有54種防御素可產(chǎn)生抗癌細(xì)胞的生物效應(yīng)

3、。此外，防御素作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與了免疫調(diào)節(jié)等多種生物功能。因此，防御素成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。生物學(xué)家們認(rèn)為防御素可能成為一種新型的抗生素，在作為抗感染制劑、食品防腐劑等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。國外有數(shù)家制藥公司在進(jìn)行防御素的開發(fā)研究，但因防御素分子太小、含特殊氨基酸較多及具有的抗微生物活性等原因，目前制約防御素產(chǎn)品走上市場的主要瓶頸依然是尚未建立成本低廉、高效穩(wěn)定的制備工藝。 人α防御素5是由小腸潘氏細(xì)胞

4、、泌尿生殖道粘膜等上皮細(xì)胞中表達(dá)的一種生物活性肽。通過對組織提取和化學(xué)合成肽的活性檢測發(fā)現(xiàn)人α防御素5既可以高效殺滅多種細(xì)菌，又具有抗病毒的生物活性。基于人α防御素5在小腸隱窩上皮細(xì)胞中組成性或誘導(dǎo)性高表達(dá)的特點(diǎn)和腸道是人體最大內(nèi)源性感染病原菌貯存庫的關(guān)聯(lián)性，我們認(rèn)為α防御素5是感染防治研究的重要靶分子。 因人α防御素5的組織提取和化學(xué)合成存在產(chǎn)量低、成本高等問題，所以基因工程制備應(yīng)該是獲得大量活性肽的理想途徑。鑒于缺乏制備重組

5、防御素相關(guān)工藝報道的現(xiàn)狀，為滿足腸道損傷修復(fù)與抗感染等研究的需求，本課題率先探索了人α防御素5的生物工程制備過程及重組產(chǎn)品的生物活性?，F(xiàn)將研究中所采用的主要方法、獲得的主要結(jié)果和結(jié)論簡述如下： 1.DEFA5基因的克隆與生物信息學(xué)分析 采用RT-PRC技術(shù)，從經(jīng)LPS誘導(dǎo)表達(dá)的LoVo細(xì)胞總RNA中克隆出DEFA5的閱讀框序列，并構(gòu)建pUCm-T-DEFA5重組載體。利用DNAStar、Antheprot5.0等生物學(xué)軟

6、件與信息平臺分析了DEFA5的信號肽、生化性質(zhì)等特點(diǎn)，篩選出生物活性可能最強(qiáng)的mHD5序列。 2.重組原核表達(dá)載體及其表達(dá)工程菌株的構(gòu)建 基于第一章所獲得的mHD5序列和有關(guān)DEFA5的信息，模擬DEFA5信號肽與前片段的性質(zhì)，篩選并克隆用于融合表達(dá)的承載分子mtrxA、trxA和malE的序列及其表達(dá)載體；同時，根據(jù)表達(dá)載體的特點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，擴(kuò)增出帶有不同克隆位點(diǎn)的mHD5片段，分別構(gòu)建了pQE-mHD5、pQE-m

7、trxA-mHD5、pET-mHD5和pMAL-mHD5表達(dá)載體及pQE-mHD5/M15、pQE-mtrxA-mHD5/M15、pET-mHD5/Rosetta-gamiB和pMAL-mHD5/BL21等工程菌株。 3.融合蛋白和rmHD5的表達(dá)、純化與活性檢測 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和表達(dá)條件的優(yōu)化，獲得了mtrxA-mHD5包涵體蛋白(MW.17135.724Da.)和trxA-mHD5(MW.20646.552Da)、m

8、alE-mHD5(MW.48602.468Da)2種可溶性融合蛋白的高效表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的比例分別為40％、26.9％和26.7％，融合蛋白中目的肽所占百分比分別為21.2％、17.4％和7.4％。分別采用親和層析、離子交換層析等不同策略對3種融合蛋白進(jìn)行純化、裂解與鑒定。從malE-mHD5酶解體系中分離純化獲得2.67mg重組目的肽，并證實(shí)對大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25923)均具

9、有抗菌活性。 4.酵母表達(dá)載體的構(gòu)建 利用Leto軟件優(yōu)化出酵母細(xì)胞偏好的mHD5密碼子，并設(shè)計(jì)合成1對長鏈引物，采用重疊延伸PCR方法擴(kuò)增mHD5優(yōu)化序列DNA。成功構(gòu)建含有mHD5天然序列和優(yōu)化序列的酵母表達(dá)載體pPIC9K-nmHD5和pPIC9K-omHD5。 5.高拷貝轉(zhuǎn)化酵母克隆的篩選與發(fā)酵工藝的建立 選用SacⅠ限制性內(nèi)切酶線型化重組表達(dá)質(zhì)粒，利用載體與GS115酵母菌株基因組在5’AOX區(qū)

10、進(jìn)行單交換同源重組可產(chǎn)生多拷貝外源基因整合的原理，采用電擊轉(zhuǎn)化、篩選和再次電擊轉(zhuǎn)化的方法，將多拷貝目的基因整合到酵母細(xì)胞基因組中。通過PCR鑒定、G418抗性篩選和表型鑒定，分別獲得了可耐受8mg/mlG418，表型為His+/Mut+的5株pPIC9K-omHD5/GS115高拷貝轉(zhuǎn)化克隆(005,007,008,009,010)和3株pPIC9K-nmHD5/GS115高拷貝轉(zhuǎn)化克隆(N06、N08、N09)。挑選O05、O08、O

11、09、N06、N08和N096株克隆在搖瓶中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)發(fā)酵，采用RT-PCR技術(shù)鑒定所挑選的6株克隆均能在mRNA水平上成功表達(dá)目的肽的基礎(chǔ)上，采用Westernblot分別對其中的4個克隆株(O05、O09、N06、N08)進(jìn)行了蛋白水平的表達(dá)鑒定，結(jié)果顯示密碼子經(jīng)優(yōu)化的mHD5表達(dá)量獲得了顯著性提高。篩選出表達(dá)量最高的克隆(O09)進(jìn)行發(fā)酵罐高密度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過2次發(fā)酵罐發(fā)酵過程的探索，綜合采用DO值監(jiān)測、酵母細(xì)胞生長活力檢測和目

12、的蛋白表達(dá)的檢測等措施，建立pPIC9K-omHD5/GS115種子工程菌的發(fā)酵罐發(fā)酵工藝，并取得不同時間段中DO值、pH值、空氣/氧化傳送速率、甘油/甲醇流加速率等參數(shù)的優(yōu)化值。獲得重組目的肽含量約10％的表達(dá)上清3.9L。 6.重組肽的純化與鑒定 采用反相層析、親和層析、離子交換層析和分子篩層析等分離方法，建立起重組肽回收率較高的純化工藝：發(fā)酵上清→Ni柱親和層析→陽離子交換層析→濃縮脫鹽層析→凍干。共獲得純化重組肽

13、152.9871mg，產(chǎn)品得率為39.2275mg/L發(fā)酵上清。產(chǎn)品經(jīng)HPLC分析，純度為81.73％，經(jīng)SDS-PAG、WesternBlot和質(zhì)譜鑒定證實(shí)產(chǎn)品成分是重組人α防御素5成熟肽。 7.生物活性檢測與作用機(jī)制探討 ①抗菌活性檢測 應(yīng)用平板法檢測了重組肽的抗菌活性，結(jié)果表明重組產(chǎn)品對3種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922、ATCC25923和ATCC27853均具有較強(qiáng)的殺滅活性。采用稀釋法測定了重組肽對14種

14、菌株(包括3種標(biāo)準(zhǔn)菌株和13種臨床分離菌株)的MIC，結(jié)果顯示產(chǎn)品具有很強(qiáng)的殺滅G-菌活性，對G+菌的作用稍弱。 ②抗菌機(jī)制初探 應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡觀察了ATCC25922和ATCC259232種菌株與重組肽作用前后的形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)了重組人α防御素5成熟肽引起G-菌細(xì)胞外膜脂質(zhì)突起，內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊，進(jìn)而導(dǎo)致菌體腫脹、破碎的現(xiàn)象；而G+菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)有明顯改變。結(jié)果顯示，人α防御素5是通過“地毯機(jī)制”作用模型發(fā)揮的抗

15、菌活性。 ③抗病毒活性檢測 首先采用MTT法檢測了重組產(chǎn)品對HeLa細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明在100ug/ml以下濃度，重組肽對細(xì)胞無毒性作用。通過基因轉(zhuǎn)染和病毒擴(kuò)增與濃縮、純化，成功制備基因組中含熒光蛋白閱讀框的重組HPV5(含紅色熒光蛋白基因)和HPV16(含綠色熒光蛋白基因)病毒液，測得后者的感染性滴度為5×1010。以HeLa細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行重組肽抑制HPV感染的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析表明重組肽對

16、HPV具有很強(qiáng)的抑制活性，且活性與濃度呈依賴關(guān)系，當(dāng)重組肽濃度達(dá)66.7ug/ml時，抑制率達(dá)90％以上。抗病毒活性的時間.效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)表明，人α防御素5抗HPV的活性發(fā)生在病毒感染細(xì)胞的早期過程，作用機(jī)制可能包括防御素作用于細(xì)胞后提高了靶細(xì)胞的抗病毒能力。 總之，本課題完成了人α防御素5的開發(fā)性研究，建立了從基因克隆、載體及其表達(dá)系統(tǒng)的選擇與構(gòu)建、表達(dá)種子工程菌的篩選、發(fā)酵表達(dá)條件的優(yōu)化與放大，直至產(chǎn)物的分離純化、生物活性測定