姜黃素功能化無(wú)機(jī)納米材料的合成及其抗病原微生物活性分析.pdf

1、病原微生物是指可以入侵機(jī)體并引起感染甚至傳染病的病原體，其中，以細(xì)菌和病毒的感染危害性最大。對(duì)于細(xì)菌感染最常用的治療策略是使用抗生素類抗菌藥物，但是，抗生素類藥物的濫用嚴(yán)重?fù)p害機(jī)體的抵抗力，加速了耐藥菌的出現(xiàn)和蔓延，對(duì)人類的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。因此，研發(fā)新型安全有效的抗菌劑和尋找新的抗菌策略是人類面臨的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。而能引發(fā)世界范圍內(nèi)嬰幼兒、免疫力低下人群下呼吸道感染的重要病原體之一—呼吸道合胞病毒（respiratory syncyti

2、al virus，RSV），到目前為止仍然沒(méi)有安全、經(jīng)濟(jì)有效的疫苗或者藥物可以用于RSV感染的預(yù)防和治療。姜黃素是一種天然的多酚類藥物，具有優(yōu)良的抗菌、抗病毒等藥理活性，但是水溶性差、生物利用度低的缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用。而銀納米材料具有廣譜殺死病原微生物的特性，氧化石墨烯具有制備簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、易修飾、表面積大等優(yōu)點(diǎn)，在抗菌和作為藥物載體等方面有廣泛應(yīng)用。因此，我們希望通過(guò)一定的方法將姜黃素和納米材料比較好的結(jié)合成為一個(gè)復(fù)合體，使

3、其兼具姜黃素的藥理活性和納米材料的獨(dú)特性能，通過(guò)納米材料提高姜黃素的藥理活性，更有效地對(duì)抗病原微生物的感染?；诖?，本文以姜黃素和納米材料為著手點(diǎn)，制備了姜黃素功能化的無(wú)機(jī)納米材料，并對(duì)其抗病原微生物的活性進(jìn)行分析。具體的研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　　1.姜黃素-銀納米顆粒的制備及其抗病原微生物活性分析
　?。?）姜黃素-銀納米顆粒的制備。我們利用藥物姜黃素自身具有一定的還原性，以姜黃素和硝酸銀為主要原料，100 ℃、一步

4、法合成粒徑均一、單分散性好、生物相容性好的姜黃素-銀納米顆粒。制備的姜黃素-銀納米顆粒的等離子共振吸收峰在410 nm處，姜黃素在反應(yīng)體系中同時(shí)扮演著還原劑和包被劑的角色，通過(guò)調(diào)節(jié)姜黃素的用量可以得到粒徑在10-50 nm范圍內(nèi)的銀納米顆粒。通過(guò)對(duì)納米顆粒紅外光譜的分析，姜黃素酮基中的氧與銀發(fā)生了配位作用，使姜黃素包裹在銀納米顆粒表面；姜黃素分子中的羥基和甲氧基得到了一定程度的保留，而羥基和甲氧基對(duì)姜黃素發(fā)揮很多藥理作用都起到非常重要的

5、作用。因此，我們預(yù)測(cè)姜黃素-銀納米顆粒可能兼具姜黃素的一些藥理活性和銀納米顆粒的優(yōu)良特性，在分析檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)等方面有良好的應(yīng)用前景。
　?。?）姜黃素-銀納米顆粒的抗菌活性分析。我們選擇了常見(jiàn)的革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌）為研究對(duì)象，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌存活率、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、納米材料的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度等來(lái)分析姜黃素-銀納米顆粒的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米顆粒的粒徑會(huì)影響姜黃素-銀納米顆粒的抗菌活性

6、，通過(guò)分析12 nm、20 nm和30 nm的姜黃素-銀納米顆粒的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)12 nm的納米顆粒的抗菌活性最好，其對(duì)抗大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度均為0.016 nM。這是由于納米顆粒粒徑越小，其比表面積越大，與細(xì)菌發(fā)生作用越充分，越容易破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此抗菌活性越強(qiáng)。通過(guò)對(duì)比姜黃素-銀納米顆粒和檸檬酸-銀納米顆粒的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)納米顆粒的包被劑也是影響抗菌活性的一個(gè)重要因素，姜黃素-銀納米顆?？咕?/p>

7、姜黃素的抗菌藥理活性和銀納米顆粒的廣譜殺菌特性協(xié)同作用的結(jié)果，因此抗菌活性優(yōu)于檸檬酸-銀納米顆粒的抗菌活性。此外，姜黃素-銀納米顆粒對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的耐藥菌株也表現(xiàn)出優(yōu)良的抗菌活性，最小抑菌濃度均為0.016 nM。
　?。?）姜黃素-銀納米顆粒的抗呼吸道合胞病毒活性分析。我們以呼吸道合胞病毒為研究模型，進(jìn)一步探討了姜黃素-銀納米顆粒的抗呼吸道合胞病毒活性。首先，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞的病變效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素-銀納米顆

8、粒與病毒發(fā)生直接作用后會(huì)很大程度地降低病毒侵染細(xì)胞的能力，不會(huì)引起細(xì)胞出現(xiàn)明顯的病變。接著，我們利用TCID50法來(lái)定量分析病毒毒力的變化，結(jié)果表明，姜黃素-銀納米顆粒與病毒發(fā)生中和作用后，會(huì)使病毒毒力下降至對(duì)照組病毒毒力的1/200，下降幅度為兩個(gè)數(shù)量級(jí)；而傳統(tǒng)的檸檬酸包被的銀納米顆粒與病毒作用后最多使病毒毒力下降至對(duì)照組病毒毒力的1/9，因此，可以發(fā)現(xiàn)姜黃素-銀納米顆粒具有更強(qiáng)的中和病毒的能力。其次，姜黃素-銀納米顆粒在預(yù)防病毒感染

9、階段會(huì)使病毒毒力下降至對(duì)照組病毒毒力的1/19；而在病毒感染之后的抑制作用階段，姜黃素-銀納米顆粒會(huì)使病毒毒力下降至對(duì)照組病毒毒力的1/13。隨后，我們又借助免疫熒光成像進(jìn)一步驗(yàn)證了以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果?；谖覀兊膶?shí)驗(yàn)結(jié)果，姜黃素-銀納米顆粒有望發(fā)展成為一種新型的呼吸道合胞病毒的高效滅活劑。
　　2.負(fù)載姜黃素的功能化石墨烯的制備及其抗呼吸道合胞病毒活性分析。
　?。?）負(fù)載姜黃素的功能化石墨烯的制備。氧化石墨烯是碳納米材料中的明星

10、材料之一，具有易制備、易修飾、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，此外，它的比表面積大是優(yōu)良的藥物載體。基于此，我們對(duì)氧化石墨烯進(jìn)行磺酸化和??環(huán)糊精的功能化修飾，使其成為姜黃素的優(yōu)良載體，并且功能化修飾后的石墨烯具有更好的分散性，吸收峰位置從最初的230 nm紅移至258 nm。姜黃素一方面可以通過(guò)嵌插入??環(huán)糊精的內(nèi)部空腔而被負(fù)載，另一方面可以與石墨烯發(fā)生π-π堆積作用而被石墨烯負(fù)載，所以功能化的石墨烯具有更高的負(fù)載姜黃素的能力，對(duì)姜黃素的包封率可

11、以達(dá)到65％，解決了姜黃素不溶于水而難以進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮藥效的難題。
　　（2）負(fù)載姜黃素的功能化石墨烯的抗呼吸道合胞病毒活性分析。我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞病變的觀察、對(duì)病毒毒力的定量測(cè)定以及分析細(xì)胞的應(yīng)答行為，詳細(xì)的分析了負(fù)載姜黃素的功能化石墨烯納米復(fù)合材料的抗呼吸道合胞病毒活性。首先，石墨烯擁有大的表面積，很容易與病毒顆粒接觸而發(fā)生中和作用，使病毒喪失感染力；其次，磺酸基的成功修飾使復(fù)合納米材料可以模擬細(xì)胞膜上的硫酸肝素糖蛋白，更易與呼吸道

12、合胞病毒發(fā)生結(jié)合，從而阻止病毒吸附到細(xì)胞膜上；再者，功能化的復(fù)合納米材料能高效地負(fù)載姜黃素進(jìn)入細(xì)胞，使姜黃素發(fā)揮抑制病毒復(fù)制和出胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在中和病毒作用階段，功能化復(fù)合納米材料用量為1.25?g/mL時(shí)病毒滴度下降至病毒對(duì)照組的1/24，當(dāng)復(fù)合納米材料用量為2.5?g/mL或更高時(shí)會(huì)使病毒完全喪失毒力，毒力下降幅度可以達(dá)到4個(gè)數(shù)量級(jí)；在預(yù)防病毒感染階段，功能化復(fù)合納米材料用量為2.5?g/mL時(shí)可以使病毒滴度下降至病毒對(duì)照

13、組的1/32，當(dāng)其用量為5.0?g/mL時(shí)可以使病毒完全喪失毒力；在病毒感染后的抑制階段，功能化復(fù)合納米材料用量為2.5?g/mL時(shí)可以使病毒滴度下降至病毒對(duì)照組的1/42，當(dāng)其用量為5.0?g/mL時(shí)可以使病毒完全喪失毒力；而在阻礙病毒吸附階段，功能化復(fù)合納米材料用量為5.0?g/mL時(shí)可以使病毒毒力下降至病毒對(duì)照組的1/42。因此，負(fù)載姜黃素的功能化石墨烯復(fù)合納米材料具有高效的抗呼吸道合胞病毒活性，在中和階段、預(yù)防階段和治療階段均具

14、有高效抗病毒作用，并且不會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，可以實(shí)現(xiàn)藥物和納米材料協(xié)同抗呼吸道合胞病毒的效果，為研制新型的抗呼吸道合胞病毒制劑和尋找新的病毒防治策略提供了思路。
　　綜上所述，本文將藥物姜黃素和無(wú)機(jī)納米材料比較好的結(jié)合在一起，制備了單分散性好、生物相容性好、性能優(yōu)良的姜黃素功能化銀納米顆粒，并對(duì)其抗菌活性和抗呼吸道合胞病毒活性進(jìn)行了詳細(xì)的分析。此外，成功構(gòu)建了負(fù)載姜黃素的功能化石墨烯納米復(fù)合材料，解決了藥物姜黃素不溶于水而難發(fā)揮藥效