蛇床子素作為殺菌劑的活性研究.pdf

1、蛇床子素(Osthol，7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素)為來(lái)源于植物的天然化合物，被證實(shí)具有抗心律失常、增強(qiáng)免疫功能、抗炎、抗病毒、抗肝損傷等廣泛的藥理活性，對(duì)交鏈孢菌(Alternaria alternata)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)及曲霉菌(Aspergillus sp.)等真菌具有抑制作用。論文作者發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)常見(jiàn)植物病原真菌具有廣譜抑菌活性。本論文以專性寄生真菌南瓜白粉病菌(Sphaerot

2、heca fuhginea)和腐生真菌小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)為材料，較為系統(tǒng)地研究了蛇床子素的抑菌與防病機(jī)制和其仿生合成衍生物抑菌譜，目的在于研究其作為衣用殺菌劑的活性及前景。主要研究結(jié)果如下： 1.抑菌譜與農(nóng)藥活性測(cè)定 離體條件下測(cè)得蛇床子素對(duì)多種常見(jiàn)植物病原真菌具有抑制活性，抑制中濃度(EC50值)大多在20μgml/L～60μgml/L之間。采用小株噴霧法和葉盤沾藥法測(cè)定蛇床子素對(duì)

3、南瓜白粉病菌EC50值分別為42.28和30.19pgml/L，且兼具良好的預(yù)防和治療效果：100μgml/L蛇床子素(未加任何農(nóng)藥助劑)其預(yù)防效果為77.41％，治療效果為68.72％。筆者所研制的1％蛇床子素水乳劑用量為33.75g.ai·hm-2時(shí)，對(duì)黃瓜白粉病防效分別達(dá)83.45～94.59％，高于對(duì)照藥劑15％三唑酮可濕性粉劑，與進(jìn)口殺菌劑10％世高水分散粒劑防效相當(dāng)。 2.防病機(jī)理 2.1對(duì)病原真菌作用

4、 顯微觀察發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)南瓜白粉病菌生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期都有影響：采用水瓊脂平板和離體葉盤法統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)100μgml/L蛇床子素在48h后對(duì)該菌分生孢子萌發(fā)抑制率90％以上并顯著降低產(chǎn)孢量；采用DAB(二氨基聯(lián)苯胺)染色法檢測(cè)植物與病原菌互作過(guò)程中的細(xì)胞學(xué)定位，發(fā)現(xiàn)蛇床子素對(duì)分生孢子入侵的抑制率達(dá)75％，從而阻止分生孢子在寄主上定殖。顯微觀察表明該化合物可有效抑制南瓜白粉病菌菌絲生長(zhǎng)，接菌48h后，對(duì)照菌絲平均長(zhǎng)度接近400μm，而蛇床子素處

5、理組菌絲平均長(zhǎng)度僅有122μm。蛇床子素可能通過(guò)降低胞外酯酶的分泌來(lái)影響白粉病菌在寄主上的黏附而阻礙白粉病菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收。掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能夠引起白粉病菌菌絲體皺縮凹陷、細(xì)胞壁消融、細(xì)胞器溶解并伴隨細(xì)胞內(nèi)容物外泄，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。但采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)和熒光顯微觀察，在短時(shí)間內(nèi)未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜通透性受到損傷，因此推斷細(xì)胞膜可能并非蛇床子素最初的作用部位。 采用對(duì)蛇床子素敏感性相當(dāng)、也表現(xiàn)孢子萌發(fā)被抑制但可離體培養(yǎng)

6、的腐生菌小麥赤霉病菌為材料研究抑菌的生化機(jī)制。結(jié)果表明液體培養(yǎng)條件下，以100μgml/L蛇床子素處理小麥赤霉菌24h，造成菌絲大量斷裂。對(duì)細(xì)胞壁形成所需底物和細(xì)胞壁水解相關(guān)酶測(cè)定，結(jié)果表明蛇床子素處理后小麥赤霉菌體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性、N-乙酰葡萄糖胺含量均升高，而β-1.6-葡聚糖酶活性與對(duì)照相比無(wú)顯著變化。在培養(yǎng)基中加入14C標(biāo)記葡萄糖，以100μgml/L蛇床子素處理小麥赤霉菌，結(jié)果表明菌體內(nèi)葡萄糖含量迅速下降，3h時(shí)達(dá)到最低，為對(duì)照

7、的51％，同時(shí)幾丁質(zhì)酶活性迅速升高為對(duì)照的3倍；由此推測(cè)可能由于糖饑餓誘導(dǎo)幾丁質(zhì)水解酶表達(dá)，引起幾丁質(zhì)前體水解，細(xì)胞壁形成受阻。以100μgml/L蛇床子素處理小麥赤霉菌后12h，處理菌體內(nèi)鈣含量?jī)H為對(duì)照的60％并改變菌絲頂端鈣離子梯度，表明蛇床子素能抑制菌體對(duì)鈣的吸收，推測(cè)其可能影響到Ca2+依賴泡囊內(nèi)含物運(yùn)輸釋放到細(xì)胞壁過(guò)程，從而影響到菌絲頂端生長(zhǎng)。 2.2對(duì)寄主的作用 除直接抑菌外，蛇床子素能夠引起南瓜葉片內(nèi)抗性相

8、關(guān)酶類如幾丁質(zhì)酶、過(guò)氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性的增強(qiáng)。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法研究了南瓜葉片內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄情況，顯示該化合物上調(diào)了葉片內(nèi)幾丁質(zhì)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平。其防病機(jī)理不僅表現(xiàn)在殺死白粉病菌、抑制其入侵過(guò)程的直接影響，而且可能誘導(dǎo)寄主的抗病能力提高。 3.其仿生合成衍生物的活性 實(shí)驗(yàn)室合成了5個(gè)含吡喃環(huán)的蛇床子素衍生物，對(duì)蔬菜、果樹、糧食上7種常見(jiàn)的病原真菌表現(xiàn)出一定活性，其中化合物JS-