葛根素對Aβ誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其機(jī)制.pdf

1、目的：Alzheimer?。ˋD）是最常見的神經(jīng)變性疾病。盡管其病因、發(fā)病機(jī)制仍不明，但已確定AD的產(chǎn)生與沉積是引發(fā)AD的重要機(jī)制。大量研究證實(shí)Aβ25～35注射到大鼠海馬內(nèi)可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元丟失和學(xué)習(xí)記憶障礙等類AD的表現(xiàn)。
　　 葛根素（Puerarin）是從豆科葛屬植物野葛的干燥根中提取的一種黃酮甙類（Flavonol Glycoside）天然藥物單體，具有廣泛的藥理作用，但葛根素對AD的防治功效尚未確定。
　　 本

2、研究擬應(yīng)用Aβ25～35注射到Wistar大鼠海馬內(nèi)模擬海馬神經(jīng)元丟失和學(xué)習(xí)記憶障礙等類AD的表現(xiàn)。研究葛根素能否改善Aβ25～35誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。
　　 方法與結(jié)果：
　　 1.葛根素對Aβ誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響
　　 用Morris水迷宮試驗(yàn)來評測Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。在定位導(dǎo)航試驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，所有大鼠尋找水下平臺的平均逃避潛伏期（AEL）越來越短，表

3、明所有大鼠均具有通過訓(xùn)練學(xué)習(xí)，對水下的平臺的空間定位獲得認(rèn)知并產(chǎn)生記憶的能力。5天訓(xùn)練期間的前3天，Aβ組與對照組比較大鼠平均AEL明顯延長，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Aβ25～35海馬注射導(dǎo)致Aβ組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙；葛根素組與Aβ組比較AEL減短，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而葛根素組大鼠的AEL與對照組大鼠比較，兩者之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示葛根素治療能改善Aβ25～35海馬注射誘導(dǎo)的Wistar大鼠學(xué)習(xí)記憶能力障礙。訓(xùn)練后2天所有大

4、鼠認(rèn)知和記憶能力接近達(dá)穩(wěn)定水平，各組AEL比較差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 空間探索試驗(yàn)中，Aβ組大鼠多圍繞池壁游泳，在迷宮外環(huán)停留時(shí)間較長，對照組和葛根素組大鼠多在原水下平臺所在象限內(nèi)徘徊。Aβ組與對照組相比跨平臺次數(shù)明顯減少；而在葛根素組大鼠的跨平臺次數(shù)比Aβ組明顯增加。提示Aβ海馬注射導(dǎo)致大鼠空間記憶力下降，葛根素治療能減輕Aβ誘導(dǎo)的大鼠空間記憶力下降。這一結(jié)果也與上述定位導(dǎo)航試驗(yàn)結(jié)果相互印證。
　　 2.葛根素對

5、Aβ誘導(dǎo)的大鼠海馬炎性反應(yīng)的干預(yù)效應(yīng)
　　 HE染色后觀察，對照組Wistar大鼠海馬的錐體細(xì)胞帶結(jié)構(gòu)完整、清晰，神經(jīng)元呈多層，排列規(guī)則、整齊、緊密。神經(jīng)元胞漿邊界清晰，胞核呈圓形，飽滿清晰，核仁明顯。Aβ組大鼠海馬顯示明顯的炎性反應(yīng)：海馬錐體細(xì)胞帶結(jié)構(gòu)紊亂，層數(shù)減少，層次不清，錐體細(xì)胞帶間及周圍聚集大量炎性細(xì)胞，甚至有的出現(xiàn)“斷帶”現(xiàn)象：一段的錐體細(xì)胞帶中的神經(jīng)元全部丟失，被大量炎性細(xì)胞和細(xì)胞碎片所取代。神經(jīng)元數(shù)目減少，分布不

6、均勻，有疏有密，大小不一，形態(tài)異常，有的胞漿、胞核邊界不清，有的著色深，有的著色淺，甚至“空泡化”。葛根素組大鼠海馬的炎性反應(yīng)輕微：海馬錐體細(xì)胞帶仍保持結(jié)構(gòu)完整性，但有的出現(xiàn)細(xì)胞層數(shù)減少，層次混亂，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，存在神經(jīng)元形態(tài)異常，“空泡化”現(xiàn)象少見。嗜銀染色光鏡下觀察，對照組大鼠海馬神經(jīng)纖維密集，走行有規(guī)律，排列清晰整齊；Aβ組大鼠海馬神經(jīng)纖維間隙擴(kuò)大，有的神經(jīng)纖維變粗或粗細(xì)不等，排列紊亂，著色深淺不一；葛根素組大鼠海馬神經(jīng)纖

7、維排列較整齊，與對照組接近。
　　 結(jié)果提示，海馬注射Aβ25-35誘導(dǎo)的強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)可能是Aβ25-35誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙的病理學(xué)基礎(chǔ)，而葛根素改善Aβ25-35誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)記憶障礙的一個(gè)重要的病理學(xué)機(jī)制可能是通過抑制Aβ誘導(dǎo)的海馬強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.葛根素抑制Aβ誘導(dǎo)的海馬炎性反應(yīng)的分子機(jī)制
　　 轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB（NF-κB）信號通路在AD腦中的炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。核內(nèi)NF-κB的p

8、65亞單位的表達(dá)水平可顯示NF-κB的活化程度。免疫組織化學(xué)染色顯示，p65亞單位的免疫反應(yīng)陽性顆粒位于胞漿和胞核內(nèi)。對照組大鼠海馬神經(jīng)元p65亞單位的陽性細(xì)胞少，著色淺。Aβ組較對照組顯著增多，著色深。葛根素組較Aβ組海馬神經(jīng)元p65亞單位的免疫陽性細(xì)胞明顯減少，著色淺。用Western blot分析的方法顯示大鼠海馬組織p65亞單位的表達(dá)，對照組的核p65亞單位蛋白條帶淺、細(xì)，Aβ組較對照組蛋白條帶明顯加深、加粗，而葛根素組較Aβ組

9、明顯變淺、細(xì)。蛋白條帶用Bio ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量得到相對密度比值量進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示，在對照組p65亞單位的核內(nèi)表達(dá)水平很低，在Aβ組大鼠海馬p65亞單位表達(dá)量顯著增加，而在葛根素組Aβ誘導(dǎo)的p65亞單位核內(nèi)表達(dá)量的增加被抑制，提示NF-κB信號通路在海馬注射Aβ25-35導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙的過程中被激活，葛根素則抑制NF-κB信號通路的激活。
　　 NF-κB的激活可能通過上調(diào)炎性相關(guān)誘導(dǎo)酶環(huán)氧化合酶2（COX-

10、2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）.的表達(dá)介導(dǎo)對神經(jīng)元的損害。用免疫組化染色來明確海馬神經(jīng)元COX-2和iNOS的表達(dá)定位。對照組COX-2的免疫組化染色陽性細(xì)胞很少能見到。Aβ組COX-2的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞顯著增多，著色深，細(xì)胞內(nèi)的陽性顆粒多，主要位于胞漿內(nèi)。葛根素組可見到少量COX-2的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，與Aβ組相比數(shù)量少且著色淺。使用Western blot分析的方法更準(zhǔn)確的定量分析。結(jié)果顯示，對照組COX-2的表達(dá)水平很低。A

11、β組大鼠海馬COX-2蛋白表達(dá)量顯著增加。葛根素組較Aβ組COX-2蛋白表達(dá)量減少。這提示葛根素治療可能抑制Aβ誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元內(nèi)COX-2的表達(dá)增加。
　　 4.葛根素對Aβ誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的干預(yù)效應(yīng)及其作用機(jī)制
　　 HE染色可觀察到大鼠海馬錐體細(xì)胞帶上的神經(jīng)元凋亡，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，呈多角形、三角形、長條形或紡錘形，胞核與胞漿均濃縮深染，或散在或聚集成團(tuán)，以CA1區(qū)和CA3區(qū)多見。對照組神經(jīng)元凋亡少見，散

12、在，Aβ組多見，常聚集成團(tuán)，有的完全占據(jù)海馬錐體細(xì)胞帶的一段。葛根素組介于二者之間。TUNEL染色時(shí)上述形態(tài)的神經(jīng)元大部分呈TUNEL染色陽性，證實(shí)為神經(jīng)元凋亡。計(jì)數(shù)TUNEL陽性的神經(jīng)元進(jìn)行比較，對照組TUNEL染色陽性的神經(jīng)元少見，Aβ組與對照組比較TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，葛根素組與Aβ組比較TUNEL染色陽性的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。流式細(xì)胞術(shù)測定的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡細(xì)胞率，結(jié)果顯示，對照組大鼠海馬的凋亡細(xì)胞率處于較低

13、水平，Aβ組較對照組凋亡細(xì)胞率明顯增加，葛根素組較Aβ組凋亡細(xì)胞率明顯降低。提示Aβ25～35海馬注射可誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡，葛根素對其有抑制作用。
　　 免疫組織化學(xué)染色顯示，BAX蛋白免疫組織化學(xué)染色陽性顆粒定位于神經(jīng)元胞漿。對照組大鼠海馬BAX蛋白免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元少見，Aβ組與對照組比較BAX免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元明顯增加，著色更深，葛根素組與Aβ組比較BAX免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)元明顯減少，著色變淺。Western bl

14、ot對大鼠海馬組織BAX的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，Aβ組比對照組大鼠海馬組織BAX的表達(dá)量明顯增加，葛根素組與Aβ組相比BAX的表達(dá)量明顯降低。免疫組織化學(xué)染色檢測bcl-2在大鼠海馬的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，對照組BCL-2蛋白在大鼠海馬組織有一定的基礎(chǔ)表達(dá)量，免疫反應(yīng)陽性顆粒定位于胞漿，Aβ組BCL-2陽性的神經(jīng)元比對照組明顯減少，著色淺；葛根素組與Aβ組比較BCL-2陽性的神經(jīng)元明顯增加。Western blot檢測bcl-2在大鼠海馬的

15、蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析的結(jié)果顯示，Aβ組與對照組相比，大鼠海馬組織BCL-2蛋白表達(dá)量明顯減少，葛根素組與Aβ組相比，大鼠海馬組織BCL-2蛋白表達(dá)量明顯增加。Aβ25～35海馬注射誘導(dǎo)大鼠海馬組織促凋亡蛋白BAX的表達(dá)增加，抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)減少，葛根素治療抑制Aβ誘導(dǎo)的大鼠海馬組織BAX的表達(dá)增加，且增加抗凋亡蛋白BCL-2表達(dá)量。
　　 結(jié)論：
　　 1.用Aβ25～35雙側(cè)海馬注射法成功復(fù)制大鼠AD模型，并從

16、行為、形態(tài)學(xué)上提供海馬神經(jīng)元損傷的證據(jù)。
　　 2.海馬注射Aβ25～35可通過誘導(dǎo)NF-κB信號通路激活和致炎基因COX-2和iNOS的過量表達(dá)，導(dǎo)致海馬的炎性反應(yīng)。
　　 3.Aβ25～35海馬注射可通過誘導(dǎo)大鼠海馬促凋亡蛋白Bax表達(dá)，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，并增加凋亡相關(guān)酶casepase-3的表達(dá)，從而促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡。
　　 4.給予大劑量的葛根素可改善由Aβ25～35海馬注射誘導(dǎo)的大鼠學(xué)

17、習(xí)記憶障礙。形態(tài)學(xué)分析證實(shí)，葛根素可阻止Aβ誘導(dǎo)的海馬錐體細(xì)胞帶神經(jīng)元丟失，減輕海馬神經(jīng)元的損傷，維持神經(jīng)元的正常超微結(jié)構(gòu)。
　　 5.葛根素可通過抑制Aβ誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活，和致炎基因COX-2和iNOS的過量表達(dá)，從而抑制大鼠海馬的炎性反應(yīng)，減少神經(jīng)元丟失和損傷，改善Aβ誘導(dǎo)的大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　 6.葛根素可通過抑制Aβ誘導(dǎo)的促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，且抑制凋亡相關(guān)酶c