羥乙葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、研究目的：腦血管疾病具有發(fā)病率、致殘率和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康。其病理生理機(jī)制迄今尚未完全明確，亦無(wú)理想的治療藥物。本課題在以往工作的基礎(chǔ)上，分別從體內(nèi)和體外兩方面探討腦缺血再灌注損傷的病理生理機(jī)制，著重研究新型異黃酮類(lèi)化合物羥乙葛根素對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為該化合物發(fā)展為治療缺血性腦血管病的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物提供理論基礎(chǔ)。 研究方法：本研究分為兩大部分。

2、 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： 采用經(jīng)典的栓線致可逆性大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)方法造成局灶性腦缺血再灌注損傷模型，選用不同血糖條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。正常血糖大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、局灶性腦缺血1小時(shí)再灌注48小時(shí)損傷組及損傷前1小時(shí)藥物干預(yù)組，以Longa's神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分法檢測(cè)動(dòng)物神經(jīng)損傷程度；氯化四唑(TTC)染色法測(cè)定大鼠全腦及皮層梗死面積百分比：分光光度法測(cè)定腦組織勻漿乳酸脫氫酶的含量反映腦組織細(xì)胞膜的完整性；HE染色和流式細(xì)胞學(xué)方法測(cè)定大鼠

3、海馬CA<,1>區(qū)的神經(jīng)損傷程度和細(xì)胞凋亡百分比；比色法測(cè)定腦組織勻漿乳酸水平和鈉鉀ATP酶活性間接反映腦組織能量代謝變化；硝基還原酶法測(cè)定腦組織勻漿一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)活性：放免法測(cè)定腦組織勻漿和血液中內(nèi)皮素-1(ET-1)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)的含量。并通過(guò)預(yù)先注射葡萄糖的方法制備高血糖大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、局灶性腦缺血1小時(shí)再灌注3小時(shí)損傷組及損傷前1小時(shí)藥物干預(yù)組，以TTC染色測(cè)定腦梗死面積百分比和損

4、傷側(cè)腦組織水腫程度；免疫印跡法測(cè)定損傷腦組織皮層錳一超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、Complexin Ⅰ、Complexin Ⅱ和谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST的蛋白表達(dá)量。 體外實(shí)驗(yàn)： 應(yīng)用培養(yǎng)的新生大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，以連二亞硫酸鈉和無(wú)糖earle's液造成化學(xué)性糖氧剝奪(OGD)模型，繼而恢復(fù)完全培養(yǎng)基模擬體內(nèi)腦缺血再灌注損傷，分別應(yīng)用MTT法和乳酸脫氫酶(LDH)漏出法檢測(cè)細(xì)胞存活率和細(xì)胞溶解程度；分光光度

5、法測(cè)定星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)乳酸水平和Na<'+>-K<'+>ATP酶活性間接反映腦組織能量代謝變化；應(yīng)用硝酸還原酶法測(cè)定細(xì)胞一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性：通過(guò)比色法分別測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。 結(jié)果：與假手術(shù)組相比，正常血糖大鼠腦缺血1小時(shí)再灌注48小時(shí)后，神經(jīng)功能?chē)?yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高；全腦及皮層梗死面積百分比顯著升高：腦組織細(xì)胞膜明顯破壞；海馬細(xì)胞明顯受損；

6、腦組織能量代謝障礙；腦組織勻漿NO含量、NOS活性、腦組織勻漿及血液中ET-1和IL-6含量顯著升高。高血糖大鼠腦缺血1小時(shí)再灌注3小時(shí)后，神經(jīng)功能亦嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為腦梗死面積百分比和損傷側(cè)腦組織水腫程度顯著升高；損傷腦組織皮層Mn-SOD、Complexin Ⅰ和Complexin Ⅱ的蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)；谷氨酸興奮性神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體GLAST的蛋白表達(dá)量顯著上調(diào)。體外培養(yǎng)的新生大鼠腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，OGD損傷1小時(shí)糖氧再恢復(fù)24小時(shí)

7、后，細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞溶解增加：細(xì)胞能量代謝障礙；細(xì)胞內(nèi)MDA水平顯著升高：SOD活性下降；細(xì)胞培養(yǎng)液中NO水平和NOS活性顯著升高。預(yù)先給予羥乙葛根素可在不同程度上逆轉(zhuǎn)或減輕腦缺血再灌注損傷的相應(yīng)變化。 結(jié)論： 1.羥乙葛根素對(duì)正常血糖條件下大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制與改善受損腦組織的能量代謝、拮抗NO介導(dǎo)的神經(jīng)毒性、減輕血管內(nèi)皮損傷及抑制炎癥細(xì)胞因子的生成有關(guān)。 2.羥乙葛根素對(duì)高血