等電聚焦理論、方法研究及其應用.pdf

1、等電聚焦(IEF)，作為雙向凝膠電泳(Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D-PAGE)第一維，在蛋白質組學研究中起著非常重要的作用。它能夠分離各種非常復雜的蛋白質混合物，一直被視為蛋白質組學分析領域的強大工具。本論文研究基于移動中和界面(Moving Neutralization Boundary，MNB)理論，研究了IEF體系運行機制，演繹了一系列I EF理論及其方

2、程，創(chuàng)建了非固化pH梯度等電聚焦（non-IPG-IEF）體系，并利用其可調性探究了其在2D-PAGE分離方法中的應用。
　　本論文共分為六章，主要內容概括如下。
　　第一章綜述了蛋白質組學研究中的關鍵分離分析技術，特別是2D-PAGE技術在組學研究中的應用，并總結了IEF兩種體系的技術發(fā)展概況，分析了各自的優(yōu)缺點。隨后著重綜述了與IEF關系密切的移動中和界面理論的起源、理論方程、理論驗證和理論的完善，分析了其與IEF的關系

3、，最后提出了本論文選題目的、意義和創(chuàng)新點。
　　第二章研究內容主要涉及研究電解質溶液電導率的新理論方法。在該研究中，單價離子的遷移率經驗方程式被選為研究對象。在離子強度≤0.05 mo l/L條件下，我們根據19種已知單價電解質溶液的電導率數據，對原本存在10％偏差的經驗方程進行了校正。校正后，方程的最大偏差縮小到了4.5％。利用校正后的方程進行預測實驗，其結果與利用移動界面方法檢測到的鹽離子確切遷移率有高度的一致性，其與在0.1

4、0 mo l/L離子強度下用Lucy方程計算的32種有機離子的遷移率也高度吻合。據此我們推導了一個更準確的公式條件，其在離子強度<0.02 mol/L下最大偏差值僅為2％。由于離子遷移率的信息可以在參考文獻中找到，且電解質電導率的檢測簡便易行，因此本方法使得對于離子遷移率的研究變的非常容易。
　　第三章研究內容主要涉及IEF電流理論方程的發(fā)展和no n-IPG-IEF體系的建立。根據Svensson-Tiselius的微分方程和M

5、NB的概念，以CAs-IEF和IPG-IEF體系中的電流為切入點，建立了CAs-IEF和IPG-IEF體系電遷移電流、擴散電流理論及其方程式，結合MNB判別式理論建立了non-IPG-IEF體系，并由IEF電流理論方程推導出IPG-IEF和non-IPG-IEF體系電導方程，隨后對其進行了實驗驗證。在這兩類IEF體系電導方程基礎上，提出基于電導檢測的I EF結果預評估方法，此方法簡單、實用，能預測IPG-IEF和non-IPG-IEF體

6、系運行樣品是否含有鹽份、膠條是否水化完全、是否有電極接觸不良等多種問題，從而快速修正實驗，提高實驗效率。
　　第四章研究內容主要涉及non-IPG-IEF和IPG-IEF穩(wěn)定性機制研究。在理論部分，根據MNB判別式理論深入分析并推導了IPG-IEF體系的判別式Rr值，通過判別式理論比較了 IP G-IEF體系中的氫離子和氫氧根離子的流通量，揭示了IPG-IEF穩(wěn)定性機制。在兩類IEF體系中，我們在電遷移電流、擴散電流理論及其方程式

7、等基礎上，演繹出導致no n-IPG-IEF平原化現象的水生成理論方程，分析了no n-IP G-IEF平原化現象的機理。最后，通過IP G-IEF體系p H梯度的動員實驗演示，進一步印證了前述理論。結果顯示，(i) IP G-IEF體系由于兩性電解質固定在凝膠基質上，氫離子和氫氧根離子的流通量基本平衡，固化pH梯度的漂移得到了很好的控制；(ii)由于non-IPG-IEF體系中兩性電解質處于游離狀態(tài)，所以體系平衡狀態(tài)時存在高擴散電流，

8、但是IPG-IEF體系中僅有微弱的電流存在；(iii)高的擴散電流導致了 non-IPG-IEF體系中水的生成量增加，進而產生較嚴重的平原化現象。
　　第五章研究內容主要是基于MRB理論的新型可調non-IPG-IEF體系的創(chuàng)建。在該體系中，通過選擇不同 R值的電極液對，演示了不同電極液對的IEF調節(jié)實驗，然后以模式蛋白為樣品分別進行了IPG-IEF與no n-IP G-IEF，對其分辨率和靈敏度進行了分析。隨后，分別以模式蛋白和

9、結腸癌細胞全蛋白為樣品，利用2DE分析軟件PD Quest分析比較了IPG-IEF和可調的non-IPG-IEF作為第一向的2DE結果的分辨率和靈敏度。結果顯示，(i)通過選擇不同的電極液對可以創(chuàng)建基于MRB的可調的pH梯度；(ii)使用non-IPG-IEF能夠取得1.65倍的分辨率改善，no n-IPG-IEF作為第一向的2DE能夠分辨模式蛋白的亞型，而這在IPG-IEF中是不能實現的；(iii)以可調的non-IPG-IEF為第一