丙型肝炎病毒感染樹鼩的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、長期以來，缺乏感染模型是丙型肝炎病毒(HCV)研究中所面臨的難題，近兩年來雖然建立了感染性的HCV細(xì)胞培養(yǎng)模型，但僅限于有限的基因型。由于缺乏理想的HCV感染小動物模型，HCV防治研究進(jìn)展緩慢。HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)療法是聚乙二醇化的IFN-α與利巴韋林的聯(lián)合應(yīng)用，2、3型HCV感染對該療法的持續(xù)反應(yīng)率達(dá)75％以上，但流行最廣的1型HCV感染的持續(xù)反應(yīng)率不到50％。此外，該療法的費(fèi)用昂貴，還具有副作用。HCV分子克隆以來，HCV疫苗在發(fā)達(dá)國家

2、一直是研究熱點(diǎn)，但迄今為止，尚無任何有效的疫苗問世。探索更加有效的HCV治療方法，研發(fā)有效的HCV疫苗非常迫切。 黑猩猩(Pan troglodytes)是目前唯一被肯定的HCV易感動物，但使用黑猩猩作為實(shí)驗(yàn)動物的費(fèi)用很高，且動物來源極為有限。近年來有Trimera小鼠和uPA-SCID小鼠被用作HCV感染模型，但兩者的制備方法復(fù)雜，且免疫缺陷的特性限制了其在HCV免疫學(xué)研究方面的應(yīng)用。 樹鼩(tree shrews，t

3、upaia belangeri)是一種與靈長目動物諸多特征相似的小動物，被用于人類多種疾病，包括HBV、HSV等病毒感染的實(shí)驗(yàn)動物模型研究。1998年首次有報道，用HCV RNA陽性的血清感染中國云南野生樹晌，部分可發(fā)生短期病毒血癥和HCV抗體陽轉(zhuǎn)，2007年再次有類似報道。盡管如此，目前對樹鼩是否可用作HCV感染的動物模型還存在爭議。 病毒體與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合是病毒進(jìn)入細(xì)胞的第一步，病毒與細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合是病毒感染

4、復(fù)制的始動環(huán)節(jié)。雖然HCV進(jìn)入靶細(xì)胞的確切機(jī)制現(xiàn)在仍不十分清楚，但一系列確鑿的證據(jù)表明這與HCV包膜糖蛋白E2與靶細(xì)胞表面的多種受體相關(guān)分子的相互作用有關(guān)，這些分子包括CD81、SR-BI、claudin-1(CLDN1)以及最近鑒定出的occludin(OCLN)。 從1997年到2008年，有一些研究表明HCV病人血漿能感染PTH(primary tupaiahepatocytes)，能感染樹鼩，但樹鼩能否作為小動物模型但是

5、仍然存在爭議。使用HCV病人血漿作為病毒來源，則無法保證研究的連貫性和重復(fù)性。因此，除臨床病毒株(病人血漿)外，使用來源穩(wěn)定、背景一致、感染性高的細(xì)胞培養(yǎng)HCV病毒代替丙型肝炎病人血漿進(jìn)行HCV動物模型的研究是最好的解決方法。 由于病毒特異性受體的表達(dá)和分布是影響病毒感染的宿主和組織親嗜性的重要限制性因素，因此關(guān)于樹鼩CD81、CLDN1、SR-BI以及OCIN功能的研究有著重要的意義。本研究克隆了樹鼩的CD81、SR-BI、C

6、LDN1以及OCLN基因，用一系列功能實(shí)驗(yàn)分析這些分子是否可介導(dǎo)HCV感染，觀察了HCV假病毒(HCVpseudopatticles，HCVpp)和細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV(cell culture produced HCV，HCVcc)對PTH的感染性，并用HCVcc體內(nèi)感染樹鼩，檢測樹鼩血清中是否可產(chǎn)生HCV病毒血癥。 方法： 1．抽提PTH的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計引物，擴(kuò)增出樹鼩CD81、SR-BI、CLDN

7、1以及OCLN基因序列。 2．構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-tCD81 LEL(large extracellular loop)，在大腸桿菌BL21中表達(dá)樹鼩CD81 LEL的重組蛋白，用ELISA分析HCV包膜E2蛋白與樹鼩CD81 LEL的結(jié)合活性。 3．構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-tCD81、pCI-tSR-BI轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測HCV E2蛋白與其結(jié)合活性。 4．將樹鼩CD81基因轉(zhuǎn)染HepG

8、2細(xì)胞，再用熒光素酶作為報告基因的假HCV顆粒(HCVpp-Luc)感染，檢測熒光素酶在細(xì)胞中的表達(dá)。 5．構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-tCLDN1，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，再用HCVpp-Luc感染，檢測熒光素酶活性。 6．將人CD81、SR-BI、CLDN1以及樹鼩OCLN共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，然后用HCVpp-Luc感染，檢測報告基因的表達(dá)。 7．分離培養(yǎng)PTH，用HCVpp-Luc感染，檢測熒光素酶活性。 8．

9、細(xì)胞培養(yǎng)的HCVcc(J6/JFH1)感染PTH，western blot檢測HCV蛋白的表達(dá)。 9．用HCVcc(J6/JFHl)感染PTH連續(xù)培養(yǎng)3周，取不同時間的培養(yǎng)上清感染Huh7.5細(xì)胞，免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)的HCV蛋白。 10.HCVcc(J6/JFH1)感染樹鼩(6只實(shí)驗(yàn)組，6只對照組)，連續(xù)十次(1次/周)取血，realtime-PCR檢測血清中HCV拷貝數(shù)，同時檢測ALT水平的變化。 結(jié)果：

10、 1．?dāng)U增出樹鼩CD81(GenBank：EF581831)，CLDN1(GenBank：EF584564)，SR-BI(GenBank：EF584564)，OCLN(GenBank：FJ809937)編碼基因。 2．?dāng)U增出樹鼩和人的CD81 LEL，并構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-tCD81 LEL、pET32a-hCD81 LEL，獲得重組蛋白。ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)人與樹鼩的CD81 LEL都能結(jié)合可溶性HCV包膜E2蛋

11、白，且二者與HCV E2的結(jié)合活性相似。 3．構(gòu)建樹鼩CD81真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)CD81分子可在CHO細(xì)胞表面表達(dá)，且CHO細(xì)胞表面的CD81分子能與可溶性HCV E2蛋白結(jié)合。 4．人或樹鼩的CD81表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞均可被HCVpp感染。 5．構(gòu)建人與樹鼩的SR-BI的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示HCV包膜E2蛋白能與表達(dá)在CHO細(xì)胞表面的SR-B1分子結(jié)合。

12、 6．轉(zhuǎn)染人或樹鼩CLDN1表達(dá)質(zhì)粒到293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能被HCVpp感染。 7．共轉(zhuǎn)染人CD81、SR-BI、CLDN1及樹鼩OCLN后CHO細(xì)胞能被HCVpp感染。 8．HCVpp和HCVcc可感染PTH，且HCVcc感染PTH可產(chǎn)生生產(chǎn)性感染。 9．J6/JFH1 HCVcc感染的6只樹鼩中，有2只血清中能間歇性檢測到HCV RNA。 結(jié)論： 1．樹鼩CD81、SR-BI、C