丙型肝炎病毒核心蛋白編碼基因鑒定與表達(dá)研究.pdf

1、目的：在中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中表達(dá)丙型肝炎病毒(HCV)核心(core，C)蛋白，為HCV C蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。 方法：1.中華倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)研究院上海細(xì)胞庫(kù)。含HCV C基因全長(zhǎng)體系重組質(zhì)粒pCMH6K由馮國(guó)和構(gòu)建，感受態(tài)菌DH5α購(gòu)自Takara公司。質(zhì)粒小劑量提取試劑盒(Takara，product No． DV801A)、限制性內(nèi)切酶BamH1購(gòu)于

2、Takara公司；脂質(zhì)體(lipofectamine2000)購(gòu)于invitrogen公司；氨芐青霉素購(gòu)自Sigma公司；瓊脂糖購(gòu)自Takara公司；細(xì)胞培養(yǎng)基D—MEM(Dulbecos modifiedeagle medium)，10％胎牛血清(fatal calf serum，F(xiàn)CS)，青、鏈霉素均購(gòu)于?？坡」尽Ｉ窖蚩故驣gG1購(gòu)于Santa公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記免抗山羊CD32購(gòu)自北京中杉公司．2.從—80℃冰箱中取出凍存的感受態(tài)

3、細(xì)胞，冰上解凍并轉(zhuǎn)化pCMH6K，參照Takara試劑盒說(shuō)明書，小劑量提取pCMH6K并經(jīng)BamH1酶切電泳鑒定。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)通過(guò)Lipofectamine2000介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCMH6K于CHO細(xì)胞。用無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM洗細(xì)胞2次，加入脂質(zhì)體/質(zhì)?；旌衔镉诹装?，加入無(wú)血清的D—MEM并于37℃，5％CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)6h，更換含有10％FCS的D—MEM繼續(xù)72h。3.免疫熒光檢測(cè)：6孔板常規(guī)培養(yǎng)pCMH6K轉(zhuǎn)染的C

4、HO細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70％時(shí)，4％的多聚甲醛固定1h；0.1％的Triton溶液打孔10min；0.1％BSA封閉1h；山羊抗鼠IgG1(0.1％BSA稀釋，稀釋度1:100)，4℃孵育過(guò)夜；暗室中加入熒光二抗(0.1％BSA稀釋，稀釋度1:100)37℃孵育1h；每次5min，50％甘油封片后于熒光顯微境下觀察細(xì)胞并拍照。 結(jié)果：所克隆的HCV C蛋白編碼基因經(jīng)酶切、電泳分析為573bp；pCMH6K轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞胞漿及