丙型肝炎病毒的檢測(cè)及基因分型新方法.pdf

1、丙型肝炎病毒(HCV)在全世界約有1.7億感染者，由于其疫苗難以研制且尚無特效藥，因此，對(duì)丙型肝炎的早期診斷是非常有意義的?，F(xiàn)階段對(duì)丙肝的常規(guī)診斷方法為PCR與ELISA，二者雖屬于成熟的檢測(cè)方式，但均較為耗時(shí)，操作繁瑣，HCV的檢測(cè)急需簡便且靈敏的方法。
　　 本文利用分子信標(biāo)與金納米顆粒針對(duì)HCV病毒RNA做了一系列檢測(cè)及基因分型的實(shí)驗(yàn)。首先是使用Duplex-specific nuclease(DSN)作為分子信標(biāo)的信號(hào)放

2、大工具，針對(duì)HCV RNA做了直接檢測(cè)。同時(shí)，還有利用該探針對(duì)HCV RNA的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)達(dá)到基因分型目的的實(shí)驗(yàn)。另外，應(yīng)用金納米顆粒，我們對(duì)HCVRNA做了靈敏而簡易的檢測(cè)。
　　 (1)通過DSN對(duì)MB與RNA的雜交產(chǎn)物進(jìn)行酶切，可實(shí)現(xiàn)RNA的重復(fù)利用，雜交信號(hào)得到了放大。DSN能將MB的檢測(cè)靈敏度提高2000倍以上。對(duì)于JFH1RNA標(biāo)準(zhǔn)樣品，我們?cè)谳^低的濃度下將其檢測(cè)了出來。然后，實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了huh7.5陽性細(xì)胞的R

3、NA。對(duì)于血清RNA樣品，此體系也能區(qū)分其陰性與陽性，且信號(hào)強(qiáng)弱與ELISA結(jié)果一致。
　　 (2)利用MB對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，即可知道模板除開引物外，其他位置的序列。本文找到了適當(dāng)?shù)腗B檢測(cè)雙鏈DNA(dsDNA)即PCR產(chǎn)物的方法和條件，以HCV的兩種亞型，JFH1與H77S病毒基因相差較大的部分為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)探針，將二者區(qū)分開來。分子信標(biāo)同雙鏈DNA分子中與之互補(bǔ)的一條進(jìn)行雜交，可在對(duì)病毒RNA PCR反應(yīng)過后，較為簡便地對(duì)

4、其基因亞型進(jìn)行確認(rèn)。
　　 (3)在鹽溶液中，金納米顆粒需要大量吸附單鏈DNA(ssDNA)在其表面才能保持膠體狀態(tài)。當(dāng)體系內(nèi)有ssDNA的互補(bǔ)RNA與其雜交時(shí)，則金顆粒會(huì)發(fā)生團(tuán)聚。利用ssDNA、金納米顆粒、鹽溶液三者，便可在有無HCVRNA存在時(shí)分別觀察到金納米顆粒的變色（聚沉）以及不變色的現(xiàn)象，另外，將反應(yīng)后的溶液在紫外-可見分光光度計(jì)中檢測(cè)金納米顆粒特有吸收峰的峰值，可更精確更靈敏地實(shí)現(xiàn)對(duì)HCV RNA的檢測(cè)。