冠狀病毒假病毒系統(tǒng)的構(gòu)建及其在受體識別中的應(yīng)用.pdf

1、冠狀病毒在自然界中普遍存在且廣泛分布，具有胃腸道、呼吸道及神經(jīng)系統(tǒng)嗜性，可引起嚴重的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。病毒識別并結(jié)合受體是病毒對細胞造成侵染的第一步，同時也決定著病毒的傳染性和致病力。冠狀病毒通過纖突蛋白(S)與細胞表面的受體結(jié)合入侵細胞，弄清病毒蛋白與細胞受體識別并結(jié)合的分子機制是研究開發(fā)抗病毒藥物的基礎(chǔ)。
　　本課題以慢病毒(Lentivirus)和水皰性口炎病毒缺失糖蛋白(VSV-△G)假病毒系統(tǒng)作為工具，通

2、過構(gòu)建不同冠狀病毒纖突蛋白的假病毒分析不同冠狀病毒對細胞的感染效率，進而研究冠狀病毒的受體識別機制。進一步通過活病毒感染試驗，對豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）進行了重點研究，期望為深入研究冠狀病毒受體識別及其入侵細胞的機制奠定基礎(chǔ)。主要包括以下3個方面內(nèi)容:
　　1.

3、構(gòu)建了VSV-△G假病毒和VSV-△G-S重組假病毒
　　利用水皰性口炎病毒(VSV)的感染性克隆系統(tǒng)，將基因組中的糖蛋白G替換成綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)，構(gòu)建VSV-△G假病毒。該種假病毒可與其它糖基化蛋白發(fā)生重組，形成具有單一糖蛋白生物學功能的重組病毒。首先在293T細胞中瞬時表達冠狀病毒纖突蛋白(S)，24h后用MOI=3的VSV-△G感染細胞，24 h后收取VSV-△G-

4、S重組假病毒。將構(gòu)建好的VSV-△G-S假病毒感染不同種屬的細胞系，分析比較不同冠狀病毒S蛋白介導病毒感染細胞的效率。結(jié)果表明，與陽性對照VSV-△G-G相比，VSV-△G-S包裝效率較低，因此嘗試利用慢病毒假病毒系統(tǒng)進行研究。
　　2.利用慢病毒假病毒系統(tǒng)研究不同冠狀病毒的細胞入侵效率
　　慢病毒載體是在HIV-1基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)。將慢病毒基因組表達質(zhì)粒(pNL4-3 LucR-E-)與冠狀病毒S蛋白的表達質(zhì)粒

5、共轉(zhuǎn)至293T細胞，構(gòu)建假病毒，并感染表達相應(yīng)受體的細胞。結(jié)果表明SARS-CoV-S假病毒的感染效率最高;MHV-S和HCoV-229E-S假病毒感染效率次之;TGEV-S和PEDV-S假病毒感染效率較高且相似;HCoV-OC43-S、BCoV-S和IBV-S假病毒對細胞的感染效果最弱且存在差異。
　　PEDV-S和TGEV-S假病毒感染豬腎細胞(PK-15)、人肝臟細胞（Huh-7）、猴腎細胞(Vero-CCL-81)和犬腎細

6、胞(MDCK)，結(jié)果顯示兩種假病毒對PK-15、Huh-7和Vero-CCL-81細胞有感染性，對MDCK不具有感染性。
　　3.PEDV和TGEV細胞嗜性的研究
　　利用PEDV和TGEV活病毒分別感染PK-15（豬腎細胞）、Huh-7（人肝臟細胞）、Vero-CCL-81（猴腎細胞）和MDCK（犬腎細胞）4種細胞系。兩種病毒均以MOI=0.5進行感染，同時加入10μg/mL胰酶促進病毒感染，在感染細胞24h后用間接免疫熒