蝙蝠SARS樣冠狀病毒Spike蛋白受體結合域在Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中的表達.pdf

1、目的：
　　 SARS冠狀病毒表面的刺突蛋白(Spike，S蛋白) 可與宿主細胞上的病毒受體血管緊張素轉化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)結合，介導病毒進入細胞。S蛋白上的受體結合功能域（Receptor Binding Domain，RBD）是能與ACE2穩(wěn)定結合的最小功能片段，在病毒的跨宿主傳播中發(fā)揮了關鍵作用。
　　 在SARS冠狀病毒溯源的研究中，研究人員在蝙蝠體內

2、發(fā)現(xiàn)SARS樣冠狀病毒（Bat SARS-LcoV），但由于Bat SARS-LCoV不能在現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)體系中有效擴增和分離，限制了直接利用活病毒對細胞或動物模型感染從而進行跨宿主傳播機制的研究工作。本研究利用桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統(tǒng)對蝙蝠SARS樣冠狀病毒（Bat SARS-LcoV）S蛋白的RBD片段進行融合表達，并初步探索其表達動力學和純化條件，旨在為進一步研究Bat SARS-Like-CoV在動物間的傳播路線和跨種屬傳播機

3、制提供實驗基礎，亦為進一步研究Bat SL-CoV S蛋白的抗原性和免疫原性提供基礎材料。
　　 方法：
　　 1、pFAST-Bat-RBD供體質粒的構建：以蝙蝠SARS樣病毒S蛋白基因第964-1542位核苷酸為目的片段設計引物，在反向引物上引入FLAG融合蛋白標簽，通過PCR獲取大量目的基因，并通過T-A克隆連接到pMD18-T載體，再通過亞克隆手段將目的基因正確插入到pFAST-HTB的多克隆位點，以構建出pFA

4、ST-Bat-RBD重組供體質粒。
　　 2、重組桿狀病毒的產(chǎn)生和滴度測定：以重組供體質粒pFAST-BAT-RBD轉化E.Coli DH10Bac感受態(tài)細胞，可使其所帶的目的基因BAT-RBD與E.Coli DH10Bac細胞內的桿狀病毒基因組（Bacmid）發(fā)生轉座重組。將重組的桿狀病毒基因組Bacmid-BAT-RBD轉染sf9昆蟲細胞，即可產(chǎn)生重組的桿狀病毒。通過檢測病毒的半數(shù)致死計量（TCID50），確定病毒的滴度。<

5、br>　　 3、重組蛋白BAT-S-RBD的產(chǎn)生和鑒定：用高滴度的病毒液以合適的感染復數(shù)（MOI）感染昆蟲細胞，72小時后收集細胞和培養(yǎng)上清液作SDS-PAGE及Western Blot檢測以明確蛋白表達的定位。并對重組蛋白的表達作時間和MOI優(yōu)化，通過鎳離子螯合樹脂純化重組蛋白。
　　 結果：
　　 1、質粒pFAST-Bat-RBD經(jīng)雙酶切、PCR鑒定和基因測序，結果證實克隆的目的基因正確插入到供體質粒，其序列與

6、蝙蝠SARS樣病毒S蛋白基因964-1542片段完全吻合，提示供體質粒pFAST-Bat-RBD構建成功。
　　 2、重組桿狀病毒基因組Bacmid-BAT-RBD的PCR檢測結果表明，目的基因已正確插入到桿狀病毒基因組中；細胞轉染桿狀病毒基因組后產(chǎn)生典型病變，以及稀釋的培養(yǎng)上清液能使正常細胞產(chǎn)生相同病變，表明重組病毒成功產(chǎn)生；通過測定病毒的半數(shù)致死計量（TCID50），得出P1病毒的濃度為8.6×106 PFU/ml，P2病毒

7、液的濃度為5.3×107 PFU/ml，P3病毒液的濃度為2.1×108 PFU/ml。
　　 3、SDS-PAGE及Western Blot檢測結果表明，昆蟲細胞感染重組桿狀病毒后，成功產(chǎn)生了重組蛋白BAT-S-RBD，其分子量約26kDa，且重組蛋白只在細胞內表達，并不能分泌到培養(yǎng)基中。重組蛋白表達的最適合MOI為2；表達峰值在感染病毒56小時到64小時之間；可通過鎳離子螯合樹脂純化重組蛋白。
　　 結論：