中東呼吸綜合征冠狀病毒病毒樣顆粒的構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)于2012年首次分離，是一種可感染人類并致死的新型冠狀病毒。中東呼吸綜合征由MERS-CoV感染所引起，癥狀表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、急性呼吸系統(tǒng)窘迫征等，嚴(yán)重者死亡，病死率達(dá)35％以上。MERS-CoV已在27個(gè)國(guó)家造成感染，感染病例多發(fā)生于中東地區(qū)，但在非洲，亞洲，南美，均有感染病例，且均與中東地區(qū)有關(guān)聯(lián)。隨

2、著世界經(jīng)濟(jì)全球化，我國(guó)與其它國(guó)家聯(lián)系緊密，往來(lái)頻繁，增加了自然感染或輸入性病例的幾率。目前，對(duì)于MERS尚無(wú)獲批的預(yù)防性疫苗或特異性治療方法。研制用于MERS預(yù)防和治療的疫苗和治療性抗體對(duì)于該病的防控、保護(hù)患者與醫(yī)療工作者的生命安全具有重要意義。
　　2015年在廣州有一起由韓國(guó)輸入的MERS病例，對(duì)我國(guó)的MERS疫情防控敲響警鐘。中國(guó)人口密度大，為防止“非典”疫情重演，研制安全性高，免疫原性強(qiáng)的疫苗及快速救治藥物，用于MERS防

3、控儲(chǔ)備，具有重要意義。
　　MERS-CoV生物安全風(fēng)險(xiǎn)高，操作活病毒可能帶來(lái)生物安全問(wèn)題，需要在生物安全等級(jí)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，且需要專業(yè)人員操作，傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗研究及其規(guī)?；a(chǎn)遇到障礙，因此探索安全有效的免疫原對(duì)于候選疫苗的制備與使用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是一種由表達(dá)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白自發(fā)裝配而成，形似真實(shí)病毒的顆粒;其本質(zhì)為蛋白質(zhì)，不含病毒核酸，無(wú)感染或復(fù)制能

4、力，安全性高;VLPs由一個(gè)或多個(gè)蛋白亞單位構(gòu)成，由于其呈高密度、重復(fù)排列，使其易于被免疫系統(tǒng)識(shí)別，因而具有良好的免疫原性。
　　為構(gòu)建MERS-CoV VLPs，將MERS-CoV纖突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(membrane，M)和包膜蛋白(envelope protein，E)基因重組至桿狀病毒表達(dá)載體，拯救重組桿狀病毒。經(jīng)基因組PCR與間接免疫熒光等方法鑒定，獲得共表達(dá)S、M和E基因的重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒感染

5、Sf9昆蟲細(xì)胞，收獲細(xì)胞上清液并通過(guò)蔗糖梯度密度離心純化后，電鏡觀察到形狀類似冠狀病毒的病毒樣顆粒，經(jīng)免疫電鏡與Western blot方法鑒定，獲得MERS-CoV VLPs。
　　為評(píng)價(jià)MERS-CoV VLPs的免疫原性，以純化的MERS-CoV VLPs作為免疫原，免疫BALB/c鼠和恒河猴，進(jìn)行MERS-CoV VLPs免疫原性的評(píng)價(jià)。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠和恒河猴血清IgG，平均效價(jià)分別為1∶384和1∶1067

6、;經(jīng)中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠和恒河猴血清中和抗體，平均效價(jià)分別為1∶208和1∶33。通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)對(duì)免疫動(dòng)物細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的分泌情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示小鼠經(jīng)MERS-CoV VLPs免疫后，在特異性抗原刺激下，可分泌IL-4顯著提高，而恒河猴分泌IFN-γ顯著增多。上述結(jié)果表明MERS-CoV VLPs對(duì)小鼠和恒河猴具有免疫原性，經(jīng)免疫的小鼠和恒河猴可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)與細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，MERS-CoV VLPs具

7、有開(kāi)發(fā)成為安全有效的新型中東呼吸綜合征疫苗的潛能。
　　抗血清療法是治療病毒和細(xì)菌等感染的快速、經(jīng)濟(jì)、有效手段。因此，本研究將MERS-CoV VLPs作為免疫原對(duì)健康馬匹進(jìn)行多次免疫，獲得馬抗MERS-CoV高免血清。通過(guò)中和試驗(yàn)監(jiān)測(cè)馬血清抗體效價(jià)，結(jié)果表明抗體效價(jià)與免疫次數(shù)呈正相關(guān)，在5次免疫后，馬抗MERS-CoV高免血清中和活性為1∶20900;在MERS-CoV小鼠感染模型上攻毒保護(hù)試驗(yàn)，分別攻毒前后肌肉注射馬抗MERS

8、-CoV高免血清可以顯著降低攻毒小鼠肺內(nèi)病毒滴度，證明其具有預(yù)防及暴露后的保護(hù)作用。馬抗MERS-CoV高免血清具備有效性，為MERS緊急救治藥物研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為進(jìn)一步探索MERS-CoV受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain，RBD)作為亞單位疫苗的可行性，利用VLPs具有展示外源表位的特性，利用表達(dá)單個(gè)蛋白即可形成病毒樣顆粒的犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV) VP2蛋白作為載

9、體，融合表達(dá)MERS-CoV RBD基因。通過(guò)對(duì)重組桿狀病毒提取基因組進(jìn)行目的片段特異性擴(kuò)增與間接免疫熒光試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定，獲得融合表達(dá)MERS-CoV RBD和CPV VP2基因的重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細(xì)胞，收獲細(xì)胞并利用飽和硫酸銨法純化VLPs，在電鏡下可觀察到形狀類似細(xì)小病毒的VLPs。通過(guò)免疫電鏡與Western blot方法對(duì)VLPs進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明獲得將MERS-CoV RBD蛋白展示于表面的嵌合型V

10、LPs。
　　為評(píng)價(jià)嵌合型MERS-CoV VLPs的免疫原性，將其作為免疫原，在BALB/c鼠上進(jìn)行免疫原性的評(píng)價(jià)。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定小鼠血清中IgG抗體效價(jià)為1∶416;通過(guò)假病毒中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠血清的中和抗體效價(jià)為1∶72。分離小鼠脾細(xì)胞并進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)免疫后在特異性抗原刺激下可分泌顯著增多的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4和IL-2。分離小鼠腹股溝淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞并進(jìn)行抗體標(biāo)記后通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)