中東呼吸綜合征冠狀病毒病毒樣顆粒的構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)于2012年首次分離，是一種可感染人類并致死的新型冠狀病毒。中東呼吸綜合征由MERS-CoV感染所引起，癥狀表現(xiàn)包括發(fā)熱、咳嗽、急性呼吸系統(tǒng)窘迫征等，嚴重者死亡，病死率達35％以上。MERS-CoV已在27個國家造成感染，感染病例多發(fā)生于中東地區(qū)，但在非洲，亞洲，南美，均有感染病例，且均與中東地區(qū)有關(guān)聯(lián)。隨

2、著世界經(jīng)濟全球化，我國與其它國家聯(lián)系緊密，往來頻繁，增加了自然感染或輸入性病例的幾率。目前，對于MERS尚無獲批的預(yù)防性疫苗或特異性治療方法。研制用于MERS預(yù)防和治療的疫苗和治療性抗體對于該病的防控、保護患者與醫(yī)療工作者的生命安全具有重要意義。
　　2015年在廣州有一起由韓國輸入的MERS病例，對我國的MERS疫情防控敲響警鐘。中國人口密度大，為防止“非典”疫情重演，研制安全性高，免疫原性強的疫苗及快速救治藥物，用于MERS防

3、控儲備，具有重要意義。
　　MERS-CoV生物安全風險高，操作活病毒可能帶來生物安全問題，需要在生物安全等級三級實驗室進行，且需要專業(yè)人員操作，傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗研究及其規(guī)?；a(chǎn)遇到障礙，因此探索安全有效的免疫原對于候選疫苗的制備與使用具有重要的現(xiàn)實意義。病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是一種由表達的病毒結(jié)構(gòu)蛋白自發(fā)裝配而成，形似真實病毒的顆粒;其本質(zhì)為蛋白質(zhì)，不含病毒核酸，無感染或復(fù)制能

4、力，安全性高;VLPs由一個或多個蛋白亞單位構(gòu)成，由于其呈高密度、重復(fù)排列，使其易于被免疫系統(tǒng)識別，因而具有良好的免疫原性。
　　為構(gòu)建MERS-CoV VLPs，將MERS-CoV纖突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(membrane，M)和包膜蛋白(envelope protein，E)基因重組至桿狀病毒表達載體，拯救重組桿狀病毒。經(jīng)基因組PCR與間接免疫熒光等方法鑒定，獲得共表達S、M和E基因的重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒感染

5、Sf9昆蟲細胞，收獲細胞上清液并通過蔗糖梯度密度離心純化后，電鏡觀察到形狀類似冠狀病毒的病毒樣顆粒，經(jīng)免疫電鏡與Western blot方法鑒定，獲得MERS-CoV VLPs。
　　為評價MERS-CoV VLPs的免疫原性，以純化的MERS-CoV VLPs作為免疫原，免疫BALB/c鼠和恒河猴，進行MERS-CoV VLPs免疫原性的評價。通過酶聯(lián)免疫吸附實驗測定小鼠和恒河猴血清IgG，平均效價分別為1∶384和1∶1067

6、;經(jīng)中和實驗測定小鼠和恒河猴血清中和抗體，平均效價分別為1∶208和1∶33。通過酶聯(lián)免疫斑點實驗對免疫動物細胞因子IFN-γ、IL-4的分泌情況進行評價，結(jié)果顯示小鼠經(jīng)MERS-CoV VLPs免疫后，在特異性抗原刺激下，可分泌IL-4顯著提高，而恒河猴分泌IFN-γ顯著增多。上述結(jié)果表明MERS-CoV VLPs對小鼠和恒河猴具有免疫原性，經(jīng)免疫的小鼠和恒河猴可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體反應(yīng)與細胞免疫反應(yīng)。因此，MERS-CoV VLPs具

7、有開發(fā)成為安全有效的新型中東呼吸綜合征疫苗的潛能。
　　抗血清療法是治療病毒和細菌等感染的快速、經(jīng)濟、有效手段。因此，本研究將MERS-CoV VLPs作為免疫原對健康馬匹進行多次免疫，獲得馬抗MERS-CoV高免血清。通過中和試驗監(jiān)測馬血清抗體效價，結(jié)果表明抗體效價與免疫次數(shù)呈正相關(guān)，在5次免疫后，馬抗MERS-CoV高免血清中和活性為1∶20900;在MERS-CoV小鼠感染模型上攻毒保護試驗，分別攻毒前后肌肉注射馬抗MERS

8、-CoV高免血清可以顯著降低攻毒小鼠肺內(nèi)病毒滴度，證明其具有預(yù)防及暴露后的保護作用。馬抗MERS-CoV高免血清具備有效性，為MERS緊急救治藥物研究奠定了基礎(chǔ)。
　　為進一步探索MERS-CoV受體結(jié)合區(qū)(receptor-binding domain，RBD)作為亞單位疫苗的可行性，利用VLPs具有展示外源表位的特性，利用表達單個蛋白即可形成病毒樣顆粒的犬細小病毒(canine parvovirus，CPV) VP2蛋白作為載

9、體，融合表達MERS-CoV RBD基因。通過對重組桿狀病毒提取基因組進行目的片段特異性擴增與間接免疫熒光試驗等方法進行鑒定，獲得融合表達MERS-CoV RBD和CPV VP2基因的重組桿狀病毒。將重組桿狀病毒感染Sf9昆蟲細胞，收獲細胞并利用飽和硫酸銨法純化VLPs，在電鏡下可觀察到形狀類似細小病毒的VLPs。通過免疫電鏡與Western blot方法對VLPs進行鑒定，結(jié)果表明獲得將MERS-CoV RBD蛋白展示于表面的嵌合型V

10、LPs。
　　為評價嵌合型MERS-CoV VLPs的免疫原性，將其作為免疫原，在BALB/c鼠上進行免疫原性的評價。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗測定小鼠血清中IgG抗體效價為1∶416;通過假病毒中和實驗測定小鼠血清的中和抗體效價為1∶72。分離小鼠脾細胞并進行酶聯(lián)免疫斑點試驗，發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)免疫后在特異性抗原刺激下可分泌顯著增多的細胞因子IFN-γ、IL-4和IL-2。分離小鼠腹股溝淋巴結(jié)中的淋巴細胞并進行抗體標記后通過流式細胞檢測，發(fā)現(xiàn)