犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒入侵宿主細(xì)胞機(jī)制研究.pdf

1、本論文對副粘病毒科的犬瘟熱病毒和冠狀病毒科的犬冠狀病毒膜融合機(jī)制進(jìn)行了初步研究。采用搭橋PCR的方法擴(kuò)增了犬瘟熱病毒HR1、HR2、HR3和FP基因及犬冠狀病毒HR1和HR2基因，分別克隆到pGEX-6p-Ⅰ表達(dá)載體中，用GST融合表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中獲得了大量融合表達(dá)蛋白，將融合蛋白用GST-3C蛋白酶酶切并純化，然后對其進(jìn)行一系列蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能學(xué)研究。圓二色譜及分子篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明犬瘟熱病毒和犬冠狀病毒的HR1和HR2蛋白都能形成穩(wěn)

2、定的富含α螺旋的三聚體結(jié)構(gòu)，說明犬瘟熱病毒和犬冠狀病毒與副粘病毒科和冠狀病毒科其它成員采用相似的膜融合機(jī)制。犬冠狀病毒在七肽重復(fù)區(qū)有14個(gè)氨基酸插入，不同于SARS-Cov和MHV，但不影響其形成六螺旋束結(jié)構(gòu)的功能。在病毒合胞體抑制實(shí)驗(yàn)中，加入體外表達(dá)的犬瘟熱病毒HR2蛋白后，能有效的抑制犬瘟熱病毒在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生的合胞體病變，而加入體外表達(dá)的犬瘟熱病毒HR1蛋白后，則不能抑制犬瘟熱病毒在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生的合胞體病變；首次證明體外

3、表達(dá)的犬瘟熱病毒HR2蛋白能特異性地抑制犬瘟熱病毒入侵宿主細(xì)胞，而犬瘟熱病毒HR1蛋白則沒有這種抑制活性。交叉抑制實(shí)驗(yàn)表明，犬瘟熱病毒重組HR1和HR2蛋白不能抑制同屬的麻疹病毒對Vero細(xì)胞的入侵。利用ExPASy系列生物學(xué)軟件對犬瘟熱病毒融合肽(FP)和三個(gè)七肽重復(fù)區(qū)的功能域分析表明FP和HR3都有較明顯的疏水趨勢，HR1與HR2既有親水區(qū)又有疏水區(qū)。圓二色譜分析表明FP富含α螺旋，HR3呈無規(guī)則卷曲，蛋白體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，HR1與