酸預(yù)處理對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、缺血預(yù)處理作為近年來受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛關(guān)注的內(nèi)源性保護(hù)策略，在各種離體及整體缺血再灌注模型中均被驗(yàn)證了其神經(jīng)保護(hù)作用，但是暫時(shí)性?shī)A閉血管的手段使其難以在臨床上應(yīng)用，所以尋找其他既具有神經(jīng)保護(hù)作用，又能在臨床上容易實(shí)施的措施顯得格外重要。低糖、低氧以及組織酸化是缺血預(yù)處理的三個(gè)要素。有研究證明酸預(yù)處理能夠保護(hù)缺血引起的心肌細(xì)胞的損傷。然而，酸預(yù)處理是否能夠保護(hù)缺血性神經(jīng)損傷目前尚不清楚。
　　目的：
　　研究酸預(yù)處理對(duì)腦缺血是

2、否存在神經(jīng)保護(hù)作用；摸索酸預(yù)處理的較優(yōu)參數(shù)，包括pH值及酸預(yù)處理的時(shí)間窗；進(jìn)一步深入分析酸預(yù)處理神經(jīng)保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　方法：
　　1、采用20-25g雄性C57BL/6小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎模型作為整體缺血再灌模型。在手術(shù)前，通過吸入5 min混合氣體(20％ CO2+21% O2+59% N2)，再吸入正常大氣10 min，如此重復(fù)3次，以降低腦內(nèi)pH。通過被動(dòng)回避的穿梭箱實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠缺血后的行為學(xué)改變。隨后立即斷頭

3、取腦，制作冰凍切片，進(jìn)行Niss1、TUNEL及DAPI染色，統(tǒng)計(jì)并分析海馬CA1區(qū)神經(jīng)元個(gè)數(shù)。
　　2、采用小鼠皮層紋狀體腦片，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)、缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)組以及各酸預(yù)處理+OGD(APC)處理組。在OGD之前，將各APC組放入pH6.8的人工腦脊液(nACSF)中分別處理1、3、5 min，然后于正常腦脊液pH7.4中處理5 min、10 min、1

4、5 min。將除Control組以外的所有腦片進(jìn)行20 min的OGD處理，再灌1h后收集腦片，檢測(cè)腦片損傷程度(TTC染色法)。選擇最優(yōu)參數(shù)后pH6.8、pH6.5和pH6.2(通過調(diào)節(jié)CO2)的APC組做相同處理從而選出最佳pH值。
　　3、采用17-18天胎鼠大腦皮層體外培養(yǎng)8-9 d的神經(jīng)元，隨機(jī)分為Control組、OGD組以及各APC處理組。在OGD之前，將各APC組的培養(yǎng)液換為pH6.8的培養(yǎng)液，放入含20% CO2

5、的培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)5 min、15 min、30 min后再次換成pH7.4的培養(yǎng)液，于5% CO2的培養(yǎng)箱中中培養(yǎng)0 min、30 min、60 min。將除Control組以外的進(jìn)行2-h的OGD處理，再灌24 h后檢測(cè)神經(jīng)元損傷程度(MTT染色法)。選出最優(yōu)參數(shù)再與Control組和OGD組通過TUNEL染色、Western blot檢測(cè)并分析其凋亡情況以及通過JC-1檢測(cè)其線粒體膜電勢(shì)的情況。并通過在APC組中加線粒體膜通透轉(zhuǎn)化

6、孔開放劑atractyloside，而后后檢測(cè)神經(jīng)元損傷程度來分析酸預(yù)處理與線粒體膜通透轉(zhuǎn)化孔的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、酸預(yù)處理組小鼠的回避時(shí)間明顯長(zhǎng)于手術(shù)組小鼠的回避時(shí)間。同時(shí)，酸預(yù)處理組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的丟失情況也得到改善。
　　2、在腦片培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)上，pH6.8和pH6.5酸預(yù)處理均具有抗腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用，但是pH6.2酸預(yù)處理不存在保護(hù)作用。給予3 min pH6.8+10 min pH7.4的酸預(yù)

7、處理明顯改善了OGD引起的損傷。
　　3、在體外神經(jīng)元培養(yǎng)上同樣也發(fā)現(xiàn)了酸預(yù)處理對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。給予15 min pH6.8+0-30 min pH7.4酸預(yù)處理明顯改善了OGD引起的神經(jīng)元損傷。凋亡率由OGD組的49.2±6.3%減為APC組的21.7±4.8%。酸預(yù)處理可抑制OGD再灌誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體膜電勢(shì)的下降，并發(fā)現(xiàn)酸預(yù)處理的保護(hù)作用可以被線粒體膜通透轉(zhuǎn)化孔開放劑atractyloside所逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：<