腦缺血預處理對沙土鼠腦缺血再灌注后HSP22表達的影響及其神經(jīng)保護作用.pdf

1、目的： 缺血性卒中以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率嚴重危害著人類健康。缺血性腦損傷的病理生理機制極為復雜，其涉及的許多相關基因和蛋白的改變及其復雜的聯(lián)系尚未研究清楚。腦缺血預處理(BIP)是指對大腦預先進行一次或多次短暫的非致死性缺血刺激后，機體獲得對致死性腦缺血的耐受性。BIP的本質是通過激發(fā)內(nèi)源性神經(jīng)保護機制，促進新的蛋白質合成，從而阻止或減弱腦缺血引起的缺血性級聯(lián)反應。HSP22是一個哺乳動物小熱休克蛋白(sHSPs)家族

2、新成員，在所有肌肉相關組織和腦組織表達，它具有分子伴侶樣活性、調(diào)節(jié)細胞凋亡等作用。本研究采用沙土鼠前腦缺血再灌注模型以及應用BIP進行干預。一方面觀察BIP對缺血腦組織超微結構、神經(jīng)細胞凋亡、HSP22mRNA及蛋白表達以及凋亡相關因子Bcl-2、BaxmRNA及蛋白表達和活化caspases-3蛋白表達變化的影響；另一方面觀察BIP對缺血腦組織MAP2、GFAPmRNA及蛋白表達變化的影響，以及通過免疫熒光共聚焦顯微鏡和免疫金雙重標記

3、電鏡觀察HSP22與MAP2是否在神經(jīng)元共定位和HSP22與GFAP是否在星形膠質細胞共定位。進一步探討B(tài)IP對沙土鼠腦缺血再灌注后HSP22表達的影響及其神經(jīng)保護作用。 方法： 1、實驗動物模型的制備及分組取健康雄性沙土鼠120只，隨機分成正常對照組、假手術組、缺血再灌注(I/R)組和預缺血(IPC)組，I/R組和IPC組又隨機分為1d、3d和7d亞組。對照組和假手術組各18只；I/R組和IPC組1d、7d亞組各12只

4、，3d亞組各18只。通過夾閉雙側頸總動脈10分鐘的方法建立沙土鼠前腦缺血再灌注模型。IPC組沙土鼠在夾閉雙側頸總動脈10分鐘前2天給予間斷一天的2次2分鐘缺血。 2、透射電鏡觀察BIP對神經(jīng)組織超微結構的改變。 3、TUNEL染色方法檢測BIP對腦組織神經(jīng)細胞凋亡的影響。 4、免疫熒光共聚焦方法觀察BIP后HSP22分別與神經(jīng)元細胞骨架蛋白MAP2和星形膠質細胞骨架蛋白GFAP共定位的情況。 5、電鏡免疫

5、金雙重標記方法觀察BIP后HSP22分別與神經(jīng)元細胞骨架蛋白MAP2和星形膠質細胞骨架蛋白GFAP共定位的情況。 6、RT-PCR方法檢測BIP對腦組織中HSP22、Bcl-2、Bax、MAP2、GFAP基因的mRNA表達的影響。 7、Western blot方法檢測BIP對腦組織中HSP22、Bcl-2、Bax、caspase-3、MAP2、GFAP蛋白表達的影響。 結果： 1、沙土鼠前腦皮層神經(jīng)細胞超

6、微結構的變化 正常對照組和假手術組前腦皮層神經(jīng)細胞超微結構正常。I/R組3d亞組可觀察到細胞核膜模糊，胞質內(nèi)線粒體多有嵴減少，外膜局部破壞，粗面內(nèi)質網(wǎng)輕度擴張。IPC組3d亞組也可觀察到上述損傷的神經(jīng)細胞，但超微結構的損傷明顯減輕。 2、沙土鼠前腦皮層TUNEL染色結果 正常對照組和假手術組沙土鼠前腦皮層幾乎未見TUNEL染色陽性細胞。I/R組1d亞組凋亡細胞數(shù)較少，3d、7d亞組凋亡細胞數(shù)明顯增多，且隨時間延長

7、，凋亡細胞數(shù)逐漸增多。IPC組在1d、3d、7d亞組凋亡細胞數(shù)分別較腦缺血再灌注組明顯減少(P<0.05)。 3、沙土鼠前腦皮層免疫熒光共聚焦結果 HSP22的紅色免疫熒光及MAP2的綠色免疫熒光在神經(jīng)元細胞漿和樹突內(nèi)發(fā)生了明顯的重疊。HSP22的紅色免疫熒光及GFAP的綠色免疫熒光在星形膠質細胞的胞體和突起發(fā)生了明顯的重疊。 4、沙土鼠前腦皮層電鏡免疫金雙重標記觀察結果 HSP22免疫金顆粒(10n

8、m)與MAP2免疫金顆粒(15nm)在神經(jīng)元細胞漿和樹突內(nèi)發(fā)生了明顯的重疊。HSP22免疫金顆粒(10nm)與GFAP免疫金顆粒(15nm)在星形膠質細胞的細胞漿和突起內(nèi)發(fā)生了明顯的重疊。 5、HSP22基因的mRNA和蛋白表達結果 預缺血組第3d腦組織HSP22mRNA表達與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)。預缺血組第1d、3d、7d腦組織HSP22蛋白表達與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)。

9、6、Bcl-2、Bax基因的mRNA和蛋白表達結果 預缺血組第3d腦組織Bcl-2mRNA表達與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)，預缺血組第1d、3d、7d腦組織Bcl-2蛋白表達與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)；缺血再灌注組第3d腦組織BaxmRNA表達與預缺血組比較顯著增加(p<0.05)，缺血再灌注組第1d、3d、7d腦組織Bax蛋白表達與預缺血組比較顯著增加(p<0.05)；預缺血組第3d腦組織Baxm

10、RNA表達與正常對照組比較差異無顯著性(p>0.05)，預缺血組第1d、3d、7d腦組織Bax蛋白表達與正常對照組比較差異無顯著性(p>0.05)。 7、活化caspase-3蛋白表達結果 預缺血組第1d、3d、7d腦組織活化caspase-3蛋白表達與缺血再灌注組比較顯著降低(p<0.05)。 8、MAP2基因的mRNA和蛋白表達結果 預缺血組第3d腦組織MAP2mRNA表達與缺血再灌注組比較顯著增加(

11、p<0.05)，預缺血組第1d、3d、7d腦組織MAP2蛋白表達與缺血再灌注組比較顯著增加(p<0.05)。 9、GFAP基因的mRNA和蛋白表達結果 預缺血組第3d腦組織GFAPmRNA表達與缺血再灌注組比較顯著降低(p<0.05)；預缺血組第1d、3d、7d腦組織GFAP蛋白表達與缺血再灌注組比較顯著降低(p<0.05)。 結論： 1、BIP能夠明顯地減輕沙土鼠缺血再灌注后前腦皮層神經(jīng)細胞超微結構的損

12、傷，減少缺血再灌注后前腦皮層神經(jīng)細胞凋亡，增加腦缺血再灌注后前腦組織抗凋亡因子Bcl-2mRNA和蛋白的表達，降低活化caspase-3蛋白的表達，而促凋亡因子BaxmRNA和蛋白的表達則沒有顯著變化。 2、BIP能夠明顯地增加沙土鼠腦缺血再灌注后前腦組織HSP22mRNA和蛋白的表達。 3、BIP能夠明顯地增加沙土鼠腦缺血再灌注后前腦組織神經(jīng)元骨架蛋白MAP2mRNA和蛋白的表達；HSP22和MAP2共定位于沙土鼠前腦