常規(guī)PCR結(jié)合CNVplex技術(shù)在檢測(cè)雞CNVs中的應(yīng)用研究.pdf

1、長(zhǎng)期進(jìn)化導(dǎo)致雞的基因組產(chǎn)生了大量的突變，這些突變對(duì)于研究雞的基因功能和生物學(xué)機(jī)制提供了思路。雞的一些性狀，如雞肉品質(zhì)，蛋用質(zhì)，羽色，雞冠，喙色等一直是科研人員研究的重點(diǎn)?？截悢?shù)變異(Copy number variations，CNVs)是指DNA長(zhǎng)度在50bp以上的堿基序列的缺失、重復(fù)、插入或這些類型的組合形式。相對(duì)于單堿基突變的SNP，CNVs所含有的遺傳信息更為豐富，也更有可能改變個(gè)體的基因表達(dá)水平進(jìn)而影響個(gè)體的表型。
　　

2、本研究以本實(shí)驗(yàn)室與湖北省欣華生態(tài)畜禽有限公司聯(lián)合培育的隱性白羽矮腳欣華雞專門化父本品系第三世代群體的443個(gè)個(gè)體為實(shí)驗(yàn)材料。首先，應(yīng)用CNVplex技術(shù)對(duì)上述群體的17個(gè)候選CNVs位點(diǎn)進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè);其次，用常規(guī)PCR對(duì)CNVplex檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和校正，以此評(píng)估CNVplex技術(shù)在雞CNVs檢測(cè)中的應(yīng)用前景，并初步摸索出一套結(jié)合常規(guī)PCR和CNVplex檢測(cè)雞CNVs的方法;最后用校正后的拷貝數(shù)與雞的蛋用性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期通

3、過(guò)CNVs位點(diǎn)與蛋用性狀之間的關(guān)聯(lián)來(lái)深入了解分子育種的基礎(chǔ)，并為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。本論文具體研究結(jié)果如下:
　　(1)篩選了可信度較高的17個(gè)候選CNVs位點(diǎn)。應(yīng)用CNVplex技術(shù)對(duì)所有443個(gè)樣本的17個(gè)候選CNVs位點(diǎn)進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，然后篩選出拷貝數(shù)變異較大的位點(diǎn)進(jìn)行下一步研究。結(jié)果顯示02A、05A、14A、14B這四個(gè)探針拷貝數(shù)變異顯著。
　　(2)對(duì)上述4個(gè)探針序列的SNP進(jìn)行檢測(cè)，并評(píng)估SNP對(duì)CNVplex

4、技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)的影響。結(jié)果顯示02A探針序列存在3個(gè)SNP(G＞A、C＞T、T＞A)，05A探針序列存在2個(gè)SNP(A＞T、C＞T)，在本實(shí)驗(yàn)群體中，這些SNP位點(diǎn)在各自探針序列上是同時(shí)出現(xiàn)的;14A、14B探針序列無(wú)SNP。
　　(3)分別對(duì)包括02A、05A、14A、14B探針序列在內(nèi)的片段進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，校正相應(yīng)小數(shù)數(shù)值為整數(shù)數(shù)值。結(jié)果顯示，探針序列存在SNP的02A、05A探針檢測(cè)的拷貝數(shù)為0（包括接近0）的樣本都能擴(kuò)

5、出相應(yīng)的目的條帶;而不存在SNP的14A、14B探針檢測(cè)的拷貝數(shù)為0（包括接近0）的樣本都不能擴(kuò)出相應(yīng)的目的條帶。最后確定14A探針和14B探針檢測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。
　　(4)以探針序列為核心區(qū)域，在14B探針上、下游每隔1kb左右設(shè)計(jì)一對(duì)引物，查找14BCNV區(qū)域的缺失邊界。最終確定在chr13:286368-292611區(qū)域約6kb的DNA片段在欣華雞中是缺失;且在14BCNV下游得到一個(gè)1.5kb的片段，該片段首次在欣華雞

6、中報(bào)道。
　　(5)對(duì)14BCNV和14ACNV與欣華雞開產(chǎn)日齡等13個(gè)蛋用性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示:14ACNV位點(diǎn)2種拷貝數(shù)變異，即奇數(shù)拷貝數(shù)組(1、3、5)和偶數(shù)拷貝數(shù)組(0、2、4)與欣華雞蛋殼厚度和蛋黃顏色是顯著相關(guān)的(P＜0.05)。14BCNV位點(diǎn)6種拷貝數(shù)變異(0、1、2、3、4、5)與欣華雞的開產(chǎn)日齡存在極顯著相關(guān)(P＜0.01)，拷貝數(shù)為5的群體開產(chǎn)日齡127.1天要顯著早于拷貝數(shù)為0的群體開產(chǎn)日齡131.9