一種多重PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:本課題利用公共引物介導(dǎo)的多重PCR技術(shù)(Universal primer-multiplexpolymerase chain reaction，UP-MPCR)，以我國(guó)批準(zhǔn)進(jìn)口（已經(jīng)頒發(fā)了安全證書）的12種轉(zhuǎn)基因大豆中轉(zhuǎn)基因序列為基因檢測(cè)靶標(biāo)，建立一種低成本、高特異性和高效的多重PCR方法體系，研發(fā)適用于加工食品中轉(zhuǎn)基因大豆成分鑒定的核酸檢測(cè)試劑盒。
　　方法:本課題包括設(shè)計(jì)引物、構(gòu)建質(zhì)粒模板、建立多重檢測(cè)體系、多重體系檢測(cè)

2、。本課題中設(shè)計(jì)引物包括公共引物、特異引物和嵌合引物。公共引物設(shè)計(jì)原則:長(zhǎng)度17～20bp、GC％含量合適、無重復(fù)序列、引物間無二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)等，經(jīng)過Blast比對(duì)修改后，要求與以轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA為模板擴(kuò)增無特異性產(chǎn)物，再以轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA為模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，篩選公共引物。將篩選出的3條公共引物通過PCR連接到一段大豆Lectin基因序列兩端，插入質(zhì)粒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證后，將陽

3、性重組質(zhì)粒梯度稀釋作為模板，用公共引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)各公共引物擴(kuò)增的敏感性。
　　通過文獻(xiàn)、數(shù)據(jù)庫(kù)和專利等搜索獲得這12種轉(zhuǎn)基因大豆(MON87701、GTS40-3-2、MON89788、CV127、A2704、A5547、DP356043、DP305423、MON87769、MON87708、305423×40-3-2、MON87701×MON89788，其中有兩種為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因大豆）插入序列和5'、3'側(cè)翼序列，采用品系特

4、異性檢測(cè)方法，在轉(zhuǎn)基因大豆插入序列與大豆基因組的5'或3'側(cè)翼連接區(qū)域設(shè)計(jì)引物，比對(duì)引物，同時(shí)進(jìn)行多重引物比對(duì)。將篩選出的公共引物連接在特異引物的5'端構(gòu)成嵌合引物，將多對(duì)嵌合引物通過以上同樣的方法進(jìn)行比對(duì)獲得最佳嵌合引物，通過PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其特異性及敏感性。本課題目的是構(gòu)建一個(gè)同時(shí)檢測(cè)12種轉(zhuǎn)基因大豆的多重檢測(cè)體系，本體系的建立包括單對(duì)嵌合引物的特異性檢測(cè)、確定擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件、多重檢測(cè)體系的特異性和敏感性檢測(cè)。本體系采用兩步溫度法

5、，前10個(gè)循環(huán)采用高退火溫度(61℃)，后30個(gè)循環(huán)采用低退火溫度(54℃)。將10種轉(zhuǎn)基因大豆的部分靶序列和部分大豆Lectin序列，通過不同的分子克隆方法構(gòu)建了4個(gè)重組質(zhì)粒陽性模板，包括含有4個(gè)目的片段的pSOYG1、含有5條目的片段的pSOYG2和2個(gè)只含有1條目的片段的重組質(zhì)粒模板。
　　結(jié)果:本課題成功設(shè)計(jì)并成功篩選出了3條公共引物，與轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA擴(kuò)增無影響結(jié)果判斷的特異性產(chǎn)物，且公共引物敏感性達(dá)

6、到100個(gè)拷貝。
　　本課題針對(duì)12種轉(zhuǎn)基因大豆和大豆內(nèi)參基因Lectin構(gòu)建了2個(gè)分別含有4個(gè)或5個(gè)目的片段的陽性重組質(zhì)粒模板pSOYG1和pSOYG2、2個(gè)只含有單個(gè)插入片段的陽性質(zhì)粒模板。其中pSOYG1含有4條目的片段，4條目的片段分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆MON87701、GTS40-3-2、MON89788和內(nèi)參基因Lectin; pSOYG2含有5條目的片段，5條目的片段分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、DP356043、

7、DP305423、CV-127、A5547-127;2個(gè)只含有單個(gè)插入片段的陽性質(zhì)粒模板，分別對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)基因大豆MON87708、 MON87769。
　　本課題構(gòu)建了用于12種轉(zhuǎn)基因大豆核酸檢測(cè)的公共引物介導(dǎo)的多重PCR檢測(cè)體系(UP-MPCR)，采用了品系特異性檢測(cè)方法，具有高特異性和高敏感性。本體系敏感性達(dá)到了0.1ng，即0.1％(0.1ng/100 ng樣品DNA)。
　　結(jié)論:本課題構(gòu)建的公共引物介導(dǎo)的多重PCR(U