光合細(xì)菌PCR檢測技術(shù)的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、本論文以光合細(xì)菌中的沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌為研究對象,根據(jù)其16S rDNA序列和gyr序列設(shè)計和篩選出適用于這兩種菌(種水平)鑒定的PCR特異引物,優(yōu)化了PCR反應(yīng)體系和程序,建立的分子生物學(xué)方法解決了微生物肥料光合細(xì)菌產(chǎn)品檢測過程中出現(xiàn)的操作繁瑣、檢測周期長等問題.進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行光合細(xì)菌含量測定研究,初步建立了定量檢測的方法,對該技術(shù)在光合細(xì)菌菌數(shù)測定中應(yīng)用做了探索性的研究. 通過分析光合細(xì)菌相關(guān)基因序

2、列的可變區(qū),設(shè)計了3對沼澤紅假單胞菌和2對類球紅細(xì)菌特異引物,根據(jù)其對各自模式菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果,篩選出了這兩種菌的PCR特異引物.通過對PCR反應(yīng)體系中鎂離子濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化,建立了沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌PCR鑒定方法.使用PCR方法對7個屬18個種共24株微生物肥料中常見光合細(xì)菌、與光合細(xì)菌常復(fù)合使用的菌種和雜菌進(jìn)行檢測,結(jié)果目的菌株均有清晰目的條帶出現(xiàn),非目的菌株均無擴(kuò)增產(chǎn)物.對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序驗證其同源性,

3、其序列與靶基因序列的同源性達(dá)100﹪.使用PCR方法檢測了來自不同企業(yè)的6個光合細(xì)菌菌劑產(chǎn)品,結(jié)果顯示PCR方法檢測符合率為100﹪,高于傳統(tǒng)的檢測方法.上述實驗結(jié)果表明,所建立的光合細(xì)菌的沼澤紅假單胞菌和類球紅細(xì)菌特異PCR檢測方法準(zhǔn)確、可靠、靈敏性強(qiáng),與傳統(tǒng)方法相比檢測步驟簡單,縮短了檢測時間. 通過比對紫色非硫菌科的光合細(xì)菌、微生物肥料常用菌種的16S rDNA序列,設(shè)計了紫色非硫菌科光合細(xì)菌的通用引物,PCR實驗結(jié)果表明

4、該對引物在微生物肥料常用的菌種范圍內(nèi),對光合細(xì)菌具有較高的特異性.使用所設(shè)計的通用引物,采用熒光定量SYBR Green I技術(shù),建立了熒光定量PCR檢測光合細(xì)菌的方法.使用該方法對系列稀釋的己知菌數(shù)樣品的DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,建立了熒光定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=-4.12x+51.52,相關(guān)系數(shù)為0.9983,檢測范圍在4.9x10<'4>CFU/mL～4.9x10<'47>CFU/mL.使用熒光定量PCR