甘藍型油菜波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復基因的圖位克隆和功能研究.pdf

1、波里馬細胞質(zhì)雄性不育(pol CMS)是甘藍型油菜雜種優(yōu)勢利用的主要途徑之一，同時也是研究核質(zhì)互作的良好載體。本研究通過圖位克隆的方法分離了波里馬細胞質(zhì)雄性不育的育性恢復基因Rfp，并利用細胞學和分子生物學方法對其進行了相關(guān)研究，闡述了Pol CMS的敗育機理及Rfp基因在甘藍型油菜中的恢復功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用不育系6330A和恢復系Bing409構(gòu)建的回交群體通過圖位克隆的方法將波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復基因（R

2、fp）定位到甘藍型油菜A9染色體上一段長約32kb的區(qū)間。對定位區(qū)間中的orf進行序列分析發(fā)現(xiàn)其中一個為PPR家族成員，將之作為候選基因構(gòu)建載體。遺傳轉(zhuǎn)化證明該orf確實是波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復基因（Rfp）。
　　2.對該基因的全長(包括啟動子區(qū)，CDS和3'UTR)在不育系1141A和恢復系Bing409中進行比較測序，比較測序結(jié)果表明Rfp與rfp啟動子區(qū)和3'UTR區(qū)分別個有一個SNP，而在CDS上存在45個SNP，導致

3、30個氨基酸的改變，其中12個氨基酸的極性發(fā)生變化。亞細胞定位的結(jié)果顯示Rfp和rfp均定位于線粒體。這表明恢復基因與其等位基因功能的差異主要是由于CDS區(qū)的變異導致，但這些變異并未引起蛋白定位的改變?；谏鲜龅臏y序結(jié)果，開發(fā)了針對Rfp的功能標記，可以高效地用于波里馬細胞質(zhì)雄性不育恢復材料的篩選和恢復系的回交選育。
　　3.半薄切片結(jié)果表明不育單株花藥在發(fā)育至第5期不能形成四個正常的角隅，向后發(fā)育也不能形成藥室或者形成1-2個形

4、態(tài)異常的藥室，而形成的藥室中小孢子的發(fā)育異常，最終不能形成花粉或者產(chǎn)生干癟的花粉。透射電鏡結(jié)果表明不育單株在花藥發(fā)育的第3期線粒體開始出現(xiàn)異常和崩解，可能引發(fā)孢原細胞的PCD，最終導致L2層細胞不能分化出正常的藥室內(nèi)壁，中層，絨氈層以及小孢子母細胞。
　　4.對Rfp基因進行RT-PCR和qPCR分析，結(jié)果表明Rfp油菜的根、莖、葉、花和幼蕾各個組織中廣泛表達，幼蕾中表達量最高，GUS分析結(jié)果與之類似，說明恢復基因可能主要在花藥發(fā)

5、育早期起重要功能。在花藥中GUS染色結(jié)果表明Rfp表達的主要部位在L2層細胞特化出的藥室內(nèi)壁，中層，絨氈層以及小孢子母細胞（小孢子）中，這與不育表型相對應。
　　5.為了探究Rfp可能的功能，以pol胞質(zhì)（不育系）和nap胞質(zhì)（保持系）線粒體組差異的orf作為探針進行Northern blot的檢測。其中以orf224作為探針檢測時發(fā)現(xiàn)在與不育系相比遺傳轉(zhuǎn)化復育系和恢復系中orf224-atp6轉(zhuǎn)錄本發(fā)生明顯減少，而保持系中基本檢

6、測不到信號。這表明Rfp可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式參與orf224轉(zhuǎn)錄本的加工從而恢復育性。
　　6.對Rfp進行預測發(fā)現(xiàn)其具有15個PPR結(jié)構(gòu)域，可能與RNA識別相關(guān)，但它本身不具有RNA剪切或者其他加工的結(jié)構(gòu)域，據(jù)此推測可能還存在其他未知蛋白參與該過程。通過酵母雙雜，在甘藍型油菜花蕾cDNA文庫中共篩選到了4個可能與Rfp互作的基因，通過BiFC的檢測證實這些互作在甘藍型油菜的線粒體中真實存在。對這些互作的基因進行了干涉，它們的