甘藍型油菜細胞核雄性不育基因BnMS5的克隆和功能分析.pdf

1、甘藍型油菜細胞核雄性不育系Rs1046A和FM195A是從Yi3A轉(zhuǎn)育而來的顯性核不育系。前人的遺傳分析研究顯示，該不育系統(tǒng)的育性受到同一位點的三個復等位基因控制，這3個復等位基因分別為BnMS5a（恢復基因），BnMS5b（不育基因）和BnMS5c（正?？捎蚺R保系基因），且3個等位基因之間的顯隱性關(guān)系為BnMS5a＞ BnMS5b＞ BnMS5c。為了闡明顯性核不育的機制，我們通過圖位克隆的方法獲得了育性調(diào)控基因BnMS5。之后，對

2、BnMS5的表達模式、起源進化和不同等位基因的功能分化進行了詳細的分析。結(jié)合細胞生物學和分子生物學方法研究顯示，BnMS5a可能通過調(diào)節(jié)減數(shù)分裂染色體的濃縮使染色體維持正常的結(jié)構(gòu)，從而保證減數(shù)分裂的順利完成。主要研究結(jié)果如下:
　　1.恢復基因BnMS5a的克隆
　　通過篩選一個包含目的等位基因BnMS5a和BnMS5b的BAC文庫，獲得了BnMS5位點的物理圖譜。結(jié)合之前研究獲得的包含BnMS5c區(qū)段的序列，根據(jù)甘藍型油菜

3、參考基因組信息，對標記BE10和SCD8間的序列進行注釋，比對不同等位基因的序列信息，選擇其中一個在三個復等位基因中序列均有差異的基因作為候選基因。通過遺傳轉(zhuǎn)化實驗確定來自于恢復系中的BnaA08g25920D可以恢復不育系的育性，即為目的等位基因BnMS5a。
　　2.BnMS5等位基因的序列分析
　　三個復等位基因的序列比對分析顯示，BnMS5a和BnMSc在編碼區(qū)序列差異較小，僅有18個氨基酸的差異，但啟動子區(qū)序列一致

4、性僅為56.1％，差異極大。BnMS5b則為BnMS5a在第二個內(nèi)含子區(qū)內(nèi)MULE類轉(zhuǎn)座子插入造成的功能缺失突變。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，BnMS5編碼一個功能未知的十字花科蕓薹屬特異蛋白，其N端有一個預測的Coiled-coil結(jié)構(gòu)域，C端為一個DUF626結(jié)構(gòu)域。
　　3.顯性核不育材料FM195A的染色體形態(tài)觀察
　　染色體展片結(jié)果觀察FM195A減數(shù)分裂各時期染色體的形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，細線期后染色體的形態(tài)開始異常，染色體不能正

5、常凝集而是相互靠近形成緊實的一團，減數(shù)分裂過程在細線期到偶線期的轉(zhuǎn)換過程中停滯。
　　4.BnMS5在減數(shù)分裂過程中的功能研究
　　45S、5SrDNA和pAtT4探針熒光原位雜交檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)M195A中同源染色體在減數(shù)分裂偶線期不能正常配對，沒有觀察到端粒的花束狀結(jié)構(gòu)。免疫熒光實驗顯示，F(xiàn)M195A中γH2AX信號與FM195B基本相同，表明DSB可正常形成;減數(shù)分裂染色體軸向元件關(guān)聯(lián)蛋白ASY1可正常定位到FM195

6、A染色體上，說明減數(shù)分裂前期Ⅰ早期染色體蛋白軸的組裝過程基本正常。而黏著蛋白（cohesin蛋白）SYN1及聯(lián)會復合體中央元件重要組分ZYP1的定位受到嚴重影響，表明MS5是減數(shù)分裂特異的聯(lián)會復合體組裝所必需的;同時，HEI10信號也沒有定位到突變體染色體上，表明MS5也是減數(shù)分裂同源重組所需的。
　　5.BnMS5的表達分析
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，BnMS5a和BnMS5c在油菜花蕾，莖和葉中均有表達。利用RNA原位

7、雜交和GUS染色技術(shù)，我們檢測了BnMS5a在油菜花藥發(fā)育各個時期以及擬南芥各個組織中的表達狀況。RNA原位雜交檢測結(jié)果顯示，BnMS5a在花粉母細胞時期花藥壁以及小孢子母細胞中可檢測到信號。GUS染色結(jié)果表明，BnMS5a在擬南芥各個組織中均有表達，其在花藥中的表達模式與原位雜交的結(jié)果基本一致。BnMS5b由于在第二個內(nèi)含子區(qū)轉(zhuǎn)座子的插入，使得基因的表達量顯著下降，RNA剪切異常，可以確定，BnMS5b是一個功能缺失基因型。轉(zhuǎn)錄和蛋白

8、表達分析顯示，MS5a的表達量最高，MS5c次之，MS5b最低。
　　6.BnMS5基因的起源和進化分析
　　分離白菜、甘藍和甘藍型油菜中的同源基因發(fā)現(xiàn)，在油菜中除BnMS5外，還有兩個同源基因:BnMS5-COPY2和BnMS5-COPY3。進化樹和序列一致性分析表明BnMS5的兩個有功能的等位基因BnMS5a和BnMS5c來源于白菜，而兩個同源基因則來源于甘藍。該基因只在蕓薹屬特異存在，是一個進化上新近產(chǎn)生的蕓薹屬特異的