骨髓動(dòng)員對(duì)外周血EPC變化及損傷動(dòng)脈血管內(nèi)膜修復(fù)的影響.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化伴有血管內(nèi)皮功能的受損,在經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療中也存在血管內(nèi)皮的剝脫損傷和修復(fù)不全.血管內(nèi)皮損傷和修復(fù)不全,是引起血管平滑肌細(xì)胞遷移和增殖的主要原因之一,也是經(jīng)皮冠脈介入治療后支架內(nèi)發(fā)生再狹窄的促發(fā)因素.現(xiàn)在有關(guān)防治再狹窄的研究較多,其主要針對(duì)的靶點(diǎn)是抑制平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖.血管內(nèi)放射治療和藥物洗脫支架通過射線或抗細(xì)胞增殖藥物作用,顯示可以明顯地抑制局部的血管平滑肌細(xì)胞過度增殖,在減少支架內(nèi)再狹窄方面的效果較為顯著,以雷

2、帕霉素為代表的藥物洗脫支架已經(jīng)在臨床上使用.但是,不管是血管內(nèi)放射或者抗細(xì)胞增殖藥物,其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制都是非特異性的,這將引起經(jīng)皮介入治療后靶血管內(nèi)皮修復(fù)不全,產(chǎn)生支架裸露、晚期支架內(nèi)血栓形成等涉及遠(yuǎn)期安全性的擔(dān)憂.在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí),如果能促進(jìn)血管內(nèi)皮的修復(fù),不但能減低介入治療后再狹窄的發(fā)生率,對(duì)改善血管的重塑、促進(jìn)其功能恢復(fù)也將有重要意義.一般認(rèn)為損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)是由損傷鄰近的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移完成,但是血管損傷處周

3、圍的內(nèi)皮細(xì)胞再生能力有限.隨著近年來(lái)對(duì)干細(xì)胞研究的深入,發(fā)現(xiàn)骨髓來(lái)源的干細(xì)胞不但參與成年個(gè)體出生后的血管新生和血管形成,而且有可能對(duì)損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)也有重要作用.已經(jīng)有研究確定外周血中存在骨髓來(lái)源的內(nèi)皮前體細(xì)胞,稱為內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell, EPC),EPC既能不斷擴(kuò)增,又能定向分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞.目前鑒定EPC的方法有細(xì)胞培養(yǎng)、免疫磁珠分選和熒光流式細(xì)胞檢測(cè)法等;在進(jìn)行雙色熒光標(biāo)記流式細(xì)

4、胞檢測(cè)時(shí),CD34+AC133+或者CD34+VEGFR2+雙陽(yáng)性細(xì)胞比例基本可反映EPC的動(dòng)態(tài)變化水平.正常生理狀態(tài)下外周血中EPC數(shù)量很少,缺血、血管損傷等因素可以使外周血中EPC數(shù)量增加,推測(cè)其可能與損傷血管的修復(fù)過程增強(qiáng)有關(guān).增強(qiáng)骨髓向外周血釋放EPC的措施,稱為骨髓動(dòng)員.已經(jīng)有報(bào)道將異體的骨髓干細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增以后,輸入血管損傷的動(dòng)物模型,可以促進(jìn)其損傷血管內(nèi)皮的修復(fù),但是藥物和細(xì)胞因子等外源性因素能否通過自體骨髓動(dòng)員增加外周血中

5、EPC的數(shù)量,并促進(jìn)損傷血管的內(nèi)皮修復(fù),尚未見更多的報(bào)道.如果能進(jìn)一步揭示藥物等外源性調(diào)節(jié)因素對(duì)在體EPC的作用環(huán)節(jié)和調(diào)控機(jī)理,必將為防治血管再狹窄和促進(jìn)損傷血管修復(fù)提供研究基礎(chǔ).在冠心病的一級(jí)或二級(jí)預(yù)防中,他汀類藥物都有顯著的作用,除降低血中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平以外,還顯示了改善血管內(nèi)皮功能的效果;粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-stimulating factor,G-CSF)則可增加外周血

6、中各種前體細(xì)胞的數(shù)量,但是它們與循環(huán)中EPC的關(guān)系還知之甚少.該實(shí)驗(yàn)擬在小鼠下肢缺血的基礎(chǔ)上給予辛伐他汀和G-CSF刺激,初步了解外周血中EPC數(shù)量的動(dòng)態(tài)改變;然后在大鼠球囊損傷血管模型上采取類似的干預(yù)手段,觀察對(duì)損傷血管內(nèi)皮修復(fù)和新生內(nèi)膜增殖效應(yīng)的影響.方法:1.小鼠下肢缺血及他汀藥物和細(xì)胞因子對(duì)外周血EPC的影響:參考文獻(xiàn)介紹的方法建立小鼠下肢缺血模型,再單獨(dú)或聯(lián)合給予辛伐他汀和G-CSF等藥物進(jìn)行骨髓動(dòng)員,術(shù)前、術(shù)后3天和術(shù)后7天

7、等不同的時(shí)間點(diǎn)取血,行外周血白細(xì)胞記數(shù)以了解骨髓動(dòng)員的程度,同時(shí)進(jìn)行外周血雙色熒光標(biāo)記流式細(xì)胞檢測(cè),測(cè)定CD34+VEGFR2+的比例,以反映在缺血及加用藥物刺激的情況下外周血EPC的變化水平.2.大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型建立及新生內(nèi)膜形成觀察:用Forgaty球囊導(dǎo)管制備大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫損傷模型,掃描電鏡觀察內(nèi)皮剝脫效果.然后給予前述干預(yù)藥物,術(shù)后2周取血管行石臘切片HE染色和PCNA免疫組化染色觀察有無(wú)新生內(nèi)膜增生及增生程度.3.大

8、鼠頸動(dòng)脈球囊損傷及藥物和細(xì)胞因子干預(yù)后外周血CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例觀察:術(shù)后2周各組取外周血進(jìn)行熒光標(biāo)記流式細(xì)胞測(cè)定,了解CD34陽(yáng)性細(xì)胞的比例,間接反映骨髓動(dòng)員程度和外周血中EPC變化水平.4.大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷及藥物和細(xì)胞因子干預(yù)后血管內(nèi)皮修復(fù)觀察:術(shù)后4周注射伊文氏藍(lán)評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮修復(fù)程度,同時(shí)測(cè)定血管環(huán)的最大舒張率和血管勻漿釋放NO的水平,以比較各組動(dòng)物經(jīng)藥物干預(yù)以后血管修復(fù)程度的功能差別.結(jié)果:1.小鼠下肢缺血及藥物干預(yù)后骨髓動(dòng)員

9、程度和外周血EPC的變化:與對(duì)照組比較,缺血后小鼠外周血CD34和VEGFR2雙陽(yáng)性細(xì)胞比例有輕度的增加;與單純?nèi)毖M相比,給予辛伐他汀對(duì)外周血白細(xì)胞數(shù)量沒有顯著的影響,給予辛伐他汀后CD34和VEGFR2雙陽(yáng)性細(xì)胞比例較單純?nèi)毖M增加;同時(shí)給予辛伐他汀和G-CSF后不但使外周血白細(xì)胞數(shù)量明顯增加,而且CD34和VEGFR2雙陽(yáng)性細(xì)胞比例也顯著增高,提示藥物和細(xì)胞因子等外源性刺激因素可以使骨髓動(dòng)員增強(qiáng),從而使外周血中EPC數(shù)量增加.各個(gè)

10、時(shí)相點(diǎn)中,CD34和VEGFR2雙陽(yáng)性細(xì)胞比例以術(shù)后2周增加最明顯,反應(yīng)外周血中EPC的數(shù)量變化有時(shí)間依賴性.2.大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型建立結(jié)果:大鼠頸動(dòng)脈經(jīng)球囊損傷后,掃描電鏡觀察證實(shí)有明顯血管內(nèi)皮剝脫.在單純球囊損傷組,損傷后2周石臘切片HE染色見明顯的新生內(nèi)膜增殖,血管腔明顯變狹窄.經(jīng)PCNA組化染色發(fā)現(xiàn)中膜和新生內(nèi)膜有較多PCNA陽(yáng)性細(xì)胞,反映其中以平滑肌細(xì)胞為主的細(xì)胞成分增殖明顯.3.藥物和細(xì)胞因子干預(yù)對(duì)新生內(nèi)膜增生程度的影響

11、:經(jīng)辛伐他汀或G-CSF干預(yù)后,損傷血管的新生內(nèi)膜增殖減輕,中膜和新生內(nèi)膜中PCNA陽(yáng)性細(xì)胞比例減低,代表新生內(nèi)膜增生程度的內(nèi)膜/中膜比值減小,其中以辛伐他汀合并G-CSF使用的效果最明顯,提示藥物干預(yù)有抑制大鼠球囊損傷后新生內(nèi)膜增殖的效果. 4.藥物和細(xì)胞因子干預(yù)對(duì)損傷血管功能的影響:手術(shù)后4周,與單純球囊損傷組比較,損傷血管經(jīng)藥物干預(yù)后在血管環(huán)張力實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出最大舒張率改善,血管勻漿釋放NO的水平增加,提示經(jīng)藥物干預(yù)可以促進(jìn)損傷血管

12、的內(nèi)皮修復(fù),內(nèi)皮依賴性血管功能得到明顯改善.5.外周血EPC與血管內(nèi)皮修復(fù)的關(guān)系:單獨(dú)給予辛伐他汀及合用辛伐他汀和G-CSF的兩組大鼠,外周血中經(jīng)熒光標(biāo)記流式細(xì)胞檢測(cè)CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例增加,在合用辛伐他汀和G-CSF組,CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例增加更明顯,同時(shí)損傷血管新生內(nèi)膜增殖程度更輕.提示外周血中EPC可能參與損傷血管的內(nèi)皮修復(fù),而且其增加的水平與修復(fù)程度相關(guān).結(jié)論:1.正常生理狀態(tài)下,外周血中存在極少量的EPC,骨髓動(dòng)員可以增加外周