核受體LXR對(duì)損傷血管內(nèi)皮修復(fù)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、1.研究背景
　　 血管內(nèi)皮損傷是介入術(shù)后的血栓形成和血管再狹窄的關(guān)鍵，也是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病血管病變等多種血管損傷性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)。血管損傷后的內(nèi)皮再生修復(fù)可以有效防止血栓形成和抑制血管平滑肌細(xì)胞的異常增生，因此，盡早促進(jìn)損傷血管的再內(nèi)皮化、恢復(fù)血管內(nèi)皮功能，是防止介入術(shù)后血栓形成和血管再狹窄，預(yù)防和治療血管損傷性疾病的有效策略。
　　 肝X受體(liver X receptor，LXR)是配體激活的

2、核受體超家族成員，被其內(nèi)源性配體/合成激動(dòng)劑激活后，可以通過調(diào)節(jié)一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)膽固醇代謝、糖代謝和炎癥反應(yīng)。近來的研究發(fā)現(xiàn)，LXR在心腦血管疾病防治中可能發(fā)揮著一定的作用：
　　 (1)LXR激動(dòng)劑可以明顯抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程；
　　 (2)LXR激動(dòng)劑可以顯著抑制血管損傷后的新生內(nèi)膜形成；
　　 (3)LXR激動(dòng)劑可以促進(jìn)缺血腦組織的新生血管形成。
　　 損傷血管內(nèi)皮的再生是上述

3、心腦血管疾病防治的共同環(huán)節(jié)，因此我們?cè)O(shè)想，LXR激活后是否可以通過促進(jìn)血管內(nèi)皮的再生，從而發(fā)揮對(duì)上述病理生理過程的調(diào)節(jié)作用?
　　 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們采用小鼠頸動(dòng)脈損傷模型觀察LXR對(duì)損傷血管的內(nèi)皮再生的影響，結(jié)果顯示，LXR激動(dòng)劑T0901317干預(yù)后，小鼠的損傷頸動(dòng)脈的再內(nèi)皮化面積明顯增加。那么LXR激活后又是如何促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的再生修復(fù)呢?血管內(nèi)皮的再生
　　 依賴于：
　　 (1)鄰近內(nèi)皮細(xì)胞(endot

4、helial cells，ECs)的增殖和遷移；
　　 (2)骨髓、脾臟等來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，EPCs能從骨髓、脾臟等動(dòng)員到外周血，遷移、歸巢于血管損傷區(qū)域，增殖和分化為ECs，還可通過旁分泌機(jī)制(分泌促血管生成因子)促進(jìn)鄰近ECs增殖和遷移，從而促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)。
　　 介于以上的研究背景，我們推測(cè)，激活LXR后可能通過調(diào)節(jié)ECs與EPCs的生物學(xué)功能(如

5、：增殖、遷移能力等)，促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的再生與修復(fù)。
　　 2.方法
　　 2.1.LXR激動(dòng)劑對(duì)小鼠頸動(dòng)脈損傷血管內(nèi)皮修復(fù)的影響
　　 構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈損傷模型，采用LXR激動(dòng)劑T0901317[30 mg/(Kg·d)]于術(shù)前2天開始喂養(yǎng)小鼠，通過伊文氏藍(lán)染色觀察損傷頸動(dòng)脈再內(nèi)皮化的情況，以闡明激活內(nèi)源性LXR對(duì)損傷血管內(nèi)皮修復(fù)的影響。
　　 2.2.LXR對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力的影響及機(jī)制研究

6、r>　　 從健康新生兒臍帶分離和培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，顯微鏡下觀察HUVECs的形態(tài)學(xué)特征，免疫熒光檢測(cè)vWF進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞鑒定；第3～5代HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。
　　 LXR激動(dòng)劑T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)處理HUVECs后，MTS方法檢測(cè)HUVECs的增殖能力，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVECs的

7、遷移能力，Western blot檢測(cè)P-Akt、總Akt、p-eNOS、總eNOS的表達(dá)。
　　 先用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預(yù)處理HUVECs30 min后，再用LXR激動(dòng)劑T0901317干預(yù)，MTS方法檢測(cè)HUVECs的增殖能力，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVECs的遷移能力，Western blot檢測(cè)p-Akt、總Akt、p-eNOS、

8、總eNOS的表達(dá)。
　　 2.3.LXR對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響及機(jī)制探討
　　 選用大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(BM-EPCs)和小鼠脾源性內(nèi)皮祖細(xì)胞(Spleen-EPCs)這兩種不同種屬和來源的EPCs作為研究模型。密度梯度離心法分離大鼠骨髓單個(gè)核
　　 細(xì)胞(MNCs)和小鼠脾臟MNCs，誘導(dǎo)分化為EPCs，顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，通過DiI-ac-LDL、FITC-UEA-I熒光雙染和流式細(xì)胞分

9、析檢測(cè)細(xì)胞分子表面標(biāo)記進(jìn)行EPCs的鑒定。培養(yǎng)第5～7天的大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs用于實(shí)驗(yàn)。
　　 采用RT-PCR、western blot和免疫熒光檢測(cè)LXRα、LXRβ在大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs中的表達(dá)和定位。
　　 LXR激動(dòng)劑T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)或GW3965(0、0.5、2、5μmol/L)干預(yù)EPCs后，MTS方法檢測(cè)EPCs的增殖能

10、力，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs的遷移能力，Western blot檢測(cè)p-Akt、總Akt、p-eNOS、總eNOS的表達(dá)。
　　 先用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預(yù)處理EPCs30 min后，再用LXR激動(dòng)劑T0901317或GW3965干預(yù)，MTS方法檢測(cè)BM-EPCs的增殖能力，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCs的遷移能力，Wester

11、n blot檢測(cè)p-Akt、總Akt、p-eNOS、總eNOS的表達(dá)。
　　 LXR激動(dòng)劑T0901317(2μmol/L)處理EPCs24 h后，RT-PCR檢測(cè)EPCs分泌的常見促血管生長因子(VEGF、SDF-1、HGF、IGF-1和G-CSF)mRNA的表達(dá)。采用LXR激動(dòng)劑T0901317(0、0.5、2、5μmol/L)或GW3965(0、0.5、2、5μmol/L)處理EPCs，不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞和細(xì)胞上清，Rea

12、l-Time PCR、western blot、ELISA檢測(cè)VEGF的mRNA、蛋白的表達(dá)和分泌。
　　 2.4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示，使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，組間比較選用單因素方差分析(One-Way ANOVA)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.結(jié)果
　　 3.1.LXR激動(dòng)劑對(duì)小鼠頸動(dòng)脈損傷血管內(nèi)皮修復(fù)的影響
　　 LXR激

13、動(dòng)劑T0901317干預(yù)后可明顯增加頸動(dòng)脈損傷后第4天、7天和14天的再內(nèi)皮化面積(P<0.05，n=8)，提示激活內(nèi)源性LXR可以明顯地促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮的再生和修復(fù)。
　　 3.2.LXR對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力的影響及機(jī)制研究
　　 3.2.1.HUVECs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 細(xì)胞呈單層生長，互不重疊，形態(tài)呈多角形、橢圓形或梭形，呈鋪路石樣鑲嵌排列；激光共聚焦顯微鏡下顯示細(xì)胞質(zhì)vWF陽性(紅色熒光)即

14、為HUVECs，鑒定陽性率>95％(n=6)。
　　 3.2.2.LXR激動(dòng)劑增強(qiáng)HUVECs增殖、遷移能力
　　 不同濃度的T0901317(0.5、2、5μmol/L)處理后，HUVECs的增殖和遷移能力明顯增強(qiáng)，并與T0901317呈一定的劑量依賴關(guān)系(P<0.05，P<0.01，n=4-6)；表明LXR激動(dòng)劑可以促進(jìn)HUVECs的增殖和遷移。
　　 3.2.3.LXR激動(dòng)劑調(diào)節(jié)HUVECs增殖、遷移能力的

15、機(jī)制研究
　　 3.2.3.1.LXR激動(dòng)劑對(duì)HUVECs中PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路的影響
　　 T0901317處理后，呈時(shí)間和劑量依賴的上調(diào)HUVECs中p-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177的表達(dá)(P<0.05，P<0.01，n=3-5)，PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)可以明顯阻斷上述作用，提示T0901317通過PI3K激活A(yù)kt/eNOS信號(hào)通路。然而在T09013

16、17干預(yù)的早期(<1 h)，未見明顯的p-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177水平上調(diào)，提示LXR激活后可能通過間接作用導(dǎo)致了HUVECs中PI3K/Akt/eNOs信號(hào)途徑的活化。
　　 3.2.3.2.LXR激動(dòng)劑通過PI3K/Akt/eNOS途徑增強(qiáng)HUVECs的增殖、遷移能力
　　 采用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預(yù)處理HUVE

17、Cs30 min后，T0901317(5μmol/L)促進(jìn)HUVECs增殖和遷移的效應(yīng)明顯減弱(P<0.05，P<0.01，n=4-6)，而LY294002和L-NAME并沒有改變HUVECs的細(xì)胞活力和基礎(chǔ)遷移水平(P=N.S.，n=4-6)；說明LXR激動(dòng)劑可以通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑增強(qiáng)HUVECs的增殖、遷移能力。
　　 3.3.LXR對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響及機(jī)制探討
　　 3.3.1.大鼠

18、BM-EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 成功分離大鼠BM-EPCs，呈梭形、橢圓形或三角形，早期可見典型的克隆單位“集落”形成；晚期呈“線型”、“管型”或者“網(wǎng)狀”血管樣生長趨勢(shì)，密度較大時(shí)呈鋪路石樣排列。DiI-ac-LDL(紅色)和FITC-UEA-I(綠色)雙染陽性即為正在分化的EPCs，所分離培養(yǎng)的細(xì)胞雙染陽性率大于90％。流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)到CD133、CD34、VEGFR-2和CD31在所培養(yǎng)細(xì)胞(5～7天)中的陽性率

19、分別為75.4％、82.3％、64.9％、86.2％和84.6％，符合EPCs的特征。
　　 3.3.2.小鼠Spleen-EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　 成功分離小鼠Spleen-EPCs，呈梭形、橢圓形或三角形，早期可見典型的克隆單位“集落”形成；晚期呈“線型”、“管型”或者“網(wǎng)狀”血管樣生長趨勢(shì)，密度較大時(shí)呈鋪路石樣排列。DiI-ac-LDL(紅色)和FITC-UEA-I(綠色)雙染陽性率大于90％，流式細(xì)胞技術(shù)

20、檢測(cè)到Sca-1、CD34、c-kit、VEGFR-2及CD31在所培養(yǎng)細(xì)胞(5～7天)中的陽性率分別為89.2％、75.4％、92.9％和91.9％，符合EPCs的特征。
　　 3.3.3.檢測(cè)LXR在EPCs的表達(dá)
　　 培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)(4天、7天、10天、14天)的大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs中，我們均檢測(cè)到LXRα、LXRβ mRNA和蛋白的表達(dá)，免疫熒光提示LXRα、LXRβ在EPCs的細(xì)胞

21、核和細(xì)胞漿均有表達(dá)，但主要表達(dá)于細(xì)胞核中；采用LXR激動(dòng)劑T0901317或GW3965處理EPCs后，LXR的靶基因ABCA1的轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào)，提示LXR在EPCs是具有轉(zhuǎn)錄活性和生物學(xué)功能的。
　　 3.3.4.LXR激動(dòng)劑增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移能力
　　 兩種不同的LXR激動(dòng)劑T0901317(0.5、2、5μmol/L)或GW3965(0.5、2、5μmol/L)處理后，大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen

22、-EPCs的增殖和遷移能力均明顯增強(qiáng)，并與LXR激動(dòng)劑呈一定的劑量依賴關(guān)系(P<0.05，P<0.01，n=4-6)；表明LXR激動(dòng)劑可以促進(jìn)EPCs的增殖和遷移。
　　 3.3.5.LXR激動(dòng)劑調(diào)節(jié)EPCs增殖、遷移能力的機(jī)制研究
　　 3.3.5.1.LXR激動(dòng)劑對(duì)EPCs中PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路的影響
　　 LXR激動(dòng)劑T0901317或GW3965處理后，呈時(shí)間和劑量依賴的上調(diào)EPCs(大鼠B

23、M-EPCs和小鼠Spleen-EPCs)中-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177的表達(dá)(P<0.05，P<0.01，n=3-5)，PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)可以明顯阻斷上述作用，提示激活LXR通過PI3K導(dǎo)致Akt/eNOS信號(hào)通路的活化。然而在LXR激動(dòng)劑干預(yù)的早期(<1h)，未見明顯的p-Akt-Ser473和p-eNOS-Ser1177水平上調(diào)，提示LXR激活后可能通過間接作用導(dǎo)致了EPCs

24、中PI3K/Akt/eNOs信號(hào)途徑的活化。
　　 3.3.5.2.LXR激動(dòng)劑通過PI3k/Akt/eNOS途徑增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移能力
　　 采用PI3K抑制劑LY294002(10μmol/L)或eNOS抑制劑L-NAME(100μmol/L)預(yù)處理EPCs(大鼠BM-EPCs和小鼠Spleen-EPCs)30 min后，T0901317(2μmol/L)和GW3965(5μmol/L)促進(jìn)EPCs增殖和遷移的

25、效應(yīng)明顯減弱(P<0.05，P<0.01，n=4-6)，而LY294002和L-NAME并沒有改變EPCs的細(xì)胞活力和基礎(chǔ)遷移水平(P=N.S.，n=4-6)；說明LXR激動(dòng)劑可以通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑增強(qiáng)EPCs的增殖、遷移能力。
　　 3.3.6.LXR激動(dòng)劑對(duì)EPCs分泌促血管生長因子的影響
　　 3.3.6.1.LXR激動(dòng)劑對(duì)EPCs中促血管生長因子(VEGF、SDF-1、HGF、IGF-1和G-

26、CSF)mRNA表達(dá)的影響
　　 LXR激動(dòng)劑T0901317(2μmol/L)作用EPCs24 h后，VEGF mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05，n=4)，而SDF-1、HGF、IGF-1和G-CSF mRNA表達(dá)水平未見明顯變化，提示LXR激動(dòng)劑可以上調(diào)EPCs中VEGF mRNA的表達(dá)。
　　 3.3.6.2.LXR激動(dòng)劑對(duì)EPCs中VEGF表達(dá)和分泌的影響
　　 LXR激動(dòng)劑T0901317或GW

27、3965作用于EPCs后，呈時(shí)間和劑量依賴的上調(diào)VEGF mRNA的表達(dá)(P<0.05，P<0.01，n=4-6)，呈劑量依賴的上調(diào)VEGF蛋白的表達(dá)(P<0.05，n=6)和促進(jìn)VEGF的分泌(P<0.05，P<0.01，n=5)，說明LXR激活后可以上調(diào)EPCs中VEGF的表達(dá)和促進(jìn)VEGF的分泌。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1.LXR激動(dòng)劑通過PI3K/Akt/eNOS信號(hào)途徑增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力；