循環(huán)肝癌細胞分子表型鑒定在指導索拉非尼個體化治療中的應用潛能研究.pdf

1、研究背景和目的
　　Ras/Raf/ERK信號通路是肝癌細胞中較為活躍的信號通路之一，也是目前唯一的肝癌靶向藥物索拉非尼的主要作用靶點。但是據(jù)報道，臨床肝癌組織樣本只有23%（25/109）表達pERK[1]，而pERK是Ras/Raf/ERK信號通路中的一個關鍵性分子。這意味著相當部分肝癌患者可能先天性缺乏對索拉非尼的敏感性。另外據(jù)報道，索拉非尼療效通常持續(xù)時間有限，其獲得性耐藥的機制在于 Ras/Raf/ERK通路受抑后PI3

2、K/AKT/mTOR通路獲得代償性活化[2]。因此，不僅在決定索拉非尼用藥前需要篩查藥物靶點，而且在用藥過程中需要不斷監(jiān)測其耐藥狀態(tài)。遺憾的是，目前臨床上尚沒有建立指導索拉非尼個體化治療的實驗室診斷技術。至于受檢樣本，我們認為在無法獲取或需要反復獲取肝癌樣本的情況下，從原發(fā)灶或轉移灶釋放進入外周血的循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）由于可多次實時采集則是最為理想的選擇。為此，本課題在篩查臨床肝癌組織樣本藥物靶點的基礎上，將以肝癌CTCs為樣本，建

3、立同時檢測上述兩條通路中的兩個代表性靶分子pERK和pAKT的多色免疫熒光染色方法，并通過臨床檢測，評價該方法的可行性以及用于指導索拉非尼個體化治療肝癌的潛能。
　　方法
　　1、應用免疫組織化學方法檢測18例臨床肝癌組織連續(xù)切片中pAKT和pERK表達，了解肝癌組織的pAKT/pERK表達譜。
　　2、將差異表達pAKT/pERK的不同肝癌細胞系分別摻入外周血（外周血肝癌CTCs模型），建立和優(yōu)化在鑒定肝癌 CTCs

4、的基礎上檢測其 pAKT/pERK表達的多色免疫熒光染色技術，其中鑒定肝癌CTCs的標志物采用目前國際上通行的廣譜細胞角蛋白（pan-cytokeratin）抗體。
　　3、采用Ficoll密度梯度離心法從臨床肝癌血樣中富集CTCs，采用離心涂片法制作細胞涂片。
　　4、采用上述所建立的多色免疫熒光染色方法檢測30例臨床肝癌CTCs樣本中pAKT/pERK表達，繪制肝癌CTCs的pAKT/pERK表達譜。
　　5、比較

5、肝癌 CTCs與對應的肝癌組織 pAKT/pERK表達檢測結果，分析二者之間的相關性。
　　6、應用索拉非尼治療8例晚期肝癌患者，比較治療前后外周血CTCs數(shù)量及其pAKT/pERK表達譜變化情況，并統(tǒng)計相關臨床病理資料及隨訪生存信息，初步評估肝癌CTCs計數(shù)及其pAKT/pERK表達譜檢測在指導索拉非尼個體化治療中的應用潛能。
　　結果
　　1、建立的CKs/pAKT/pERK多色免疫熒光染色方法可在鑒定肝癌CTCs

6、的同時檢測其pAKT/pERK表型，可準確檢測出不同細胞之間pAKT和pERK的表達差異。
　　2、在HCC組織中檢測到4種不同的pAKT/pERK表型，分別為pAKT+/pERK+、pAKT+/pERK-、pAKT-/pERK+和pAKT-/pERK-。在18例肝癌患者中，pAKT+/pERK+患者2例，占11.1%，pAKT+/pERK-患者13例，占72.2%，pAKT-/pERK+患者2例，占11.1%，pAKT-/pER

7、K-患者1例，占5.6%。其中pAKT+患者共15例，占83.3%， pERK+患者共4例，占22.2%。
　　3、在HCC CTCs中也檢測到與組織對應的4種不同的pAKT/pERK表型。
　　4、不同肝癌個體的CTCs之間pAKT/pERK表型不盡相同。在30例HCC外周血中，28例檢出CTCs，檢出率93.3%，平均31±18個。不同HCC患者具有不同表型的CTCs。28例檢出CTCs的HCC患者中4種表型分別為：pA

8、KT+/pERK+5例，占17.9%；pAKT+/pERK-18例，占64.3%；pAKT-/pERK+3例，占10.7%；pAKT-/pERK-2例，占7.1%。其中pAKT陽性患者共23例，占82.1%，pERK陽性患者共8例，占28.6%。
　　5、同一肝癌個體的不同CTCs之間pAKT/pERK表型也不盡相同。28例患者中，除5例患者體內僅檢測到1種表型的CTCs外，其余大部分患者體內同時檢測到2種或以上表型的CTCs，甚

9、至同時檢測到全部4種表型的CTCs，不同表型的CTCs數(shù)目存在差異，占所有檢出CTCs的比例也不相同。
　　6、肝癌 CTCs與對應的肝癌組織 pAKT/pERK表達檢測結果高度一致，不同pAKT/pERK分型兩種方法檢測結果之間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。在同時應用兩種方法檢測的18例患者中，除1例未檢出CTCs，其余17例中有16例檢測結果一致，占94%。其中1例組織學檢測結果為pERK-，此例患者外周血檢出27個CTCs，

10、但在這27個CTCs中檢測出8個pERK+CTCs。
　　7、8例HCC患者在接受索拉非尼治療后2周，外周血CTCs均有不同程度下降，從用藥前31±10個下降到20±12個。其中2例CTCs表型為pAKT-/pERK+的患者， CTCs數(shù)目下降程度最為顯著，分別從26個和27個下降至5個和7個，下降幅度分別為80.8%和74.1%；2例CTCs表型為pAKT+/pERK+的患者，CTCs數(shù)目下降程度較小，分別從27個和25個下降至

11、15個和13個，下降幅度分別為40.7%和48.0%；3例CTCs表型為pAKT+/pERK-的患者及1例CTCs表型為pAKT-/pERK-的患者， CTCs數(shù)目下降幅度不大，從31個、36個、53個和24個分別下降到25個、29個、43個和20個，下降幅度分別為19.3%、19.4%、18.9%和16.7%。不同分子表型CTCs下降幅度差異具有統(tǒng)計學意義。表明 pAKT-/pERK+患者對索拉非尼最為敏感， pAKT+/pERK+患

12、者次之，而pAKT+/pERK-患者和pAKT-/pERK-患者對索拉非尼不敏感。
　　結論
　　建立的 CKs/pAKT/pERK多色免疫熒光染色方法簡便實用，可用于肝癌 CTCs pAKT/pERK表型鑒定；肝癌CTCs可以替代肝癌組織進行pAKT/pERK分子表型檢測，甚至具有更多優(yōu)勢；不同肝癌個體的CTCs之間以及同一肝癌個體的不同CTCs之間pAKT/pERK表型存在異質性；肝癌CTCs pAKT/pERK表型檢測