核素標(biāo)記不同性質(zhì)單抗聯(lián)合索拉非尼治療肝癌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、索拉非尼(sorafenib)是一種小分子的多靶點(diǎn)口服抗癌新藥，臨床前研究和臨床實(shí)驗(yàn)提示索拉非尼有廣泛的抗腫瘤作用，既能抑制腫瘤血管的形成又能直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療晚期腎癌及肝癌，并且在其他實(shí)體瘤的II/III期研究中取得令人鼓舞的結(jié)果。本文的目的是研究131I—chTNT聯(lián)合131I—抗HBsAgFab片斷對荷人肝癌HepG2.2.15移植瘤生長抑制的效果，以及應(yīng)用sorafenib抑制腫

2、瘤微血管生成對131I—chTNT體內(nèi)分布的影響，為臨床提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為肝癌的多種抗體聯(lián)合放射免疫治療及與小分子藥物的配合治療提供理論基礎(chǔ)。 第一部分：抗乙肝表面抗原Fab片段聯(lián)合抗細(xì)胞核單抗為載體的肝癌放射免疫治療動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 方法： 1.建立人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15裸鼠皮下移植瘤模型：0.2ml(含活細(xì)胞1×107)人肝癌HepG2.2.15細(xì)胞(對數(shù)生長期)懸液接種裸鼠，注射部位為裸鼠右腋下部皮下。待裸

3、鼠成瘤后剝?nèi)×鲶w周圍魚肉狀組織(活性好)為瘤源，分割成1-2cm3小塊，種植于其他裸鼠右側(cè)腋窩下部皮下。 2.131I標(biāo)記抗HBsAgFab、chTNT和無關(guān)抗體IgG(Idogen法)。測量標(biāo)記物的標(biāo)記率、放化純度、穩(wěn)定性以及免疫結(jié)合率。 3.實(shí)驗(yàn)分組：將25只荷HepG2.2.15移植瘤裸鼠按瘤體積隨機(jī)分成131I—抗HBsAgFab組、131I—chTNT組、聯(lián)合用藥組、131I—無關(guān)抗體組(131I—IgG)、空

4、白對照組共五組，每組5只。 4.給藥：①131I—抗HBsAgFab組：131I—抗HBsAgFab，14.8MBq/40ul，瘤內(nèi)注射，(A組)；②131I—chTNT組：131I—chTNT，14.8MBq/40ul，瘤內(nèi)注射，(B組)；③聯(lián)合用藥組：131I—抗HBsAgFab7.4MBq/20μl+131I—chTNT7.4MBq/20μl，瘤內(nèi)注射；(C組)；④陽性對照組：131I—IgG，14.8MBq/40μl瘤內(nèi)

5、注射，(D組)；⑤陰性對照組：生理鹽水40μl瘤內(nèi)注射(E組)。 5.給藥前測量每只裸鼠體重和腫瘤大小，給藥后每天觀察裸鼠的生長、生活情況，測量腫瘤的長徑、短徑，每周兩次，按公式移植瘤體積=(長徑×短徑2)/2計(jì)算瘤體積。 6.瘤內(nèi)注射后第1、4、7天將荷瘤裸鼠麻醉后進(jìn)行SPECT顯像，計(jì)算瘤體放射性占全鼠放射性的比值和腫瘤與周圍組織放射性比值(T/NT)，觀察標(biāo)記抗體在裸鼠體內(nèi)的分布及代謝情況。第28天處死全部實(shí)驗(yàn)裸鼠

6、，計(jì)算腫瘤抑制率并取移植瘤行病理形態(tài)學(xué)觀察。 7.統(tǒng)計(jì)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，定量資料數(shù)據(jù)以—X±S表示。標(biāo)記抗體的免疫結(jié)合率比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；抗體在裸鼠體內(nèi)T/NT比值和用藥前后對照組與各處理組移植瘤體積比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Welch和Tambane'sT2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1.131I標(biāo)記抗HBsA

7、gFab和chTNT具有良好的免疫活性和穩(wěn)定性。 2.采用瘤內(nèi)注射，核素標(biāo)記抗體不需要血液循環(huán)，直接進(jìn)入腫瘤組織，可明顯增加標(biāo)記抗體在腫瘤內(nèi)的濃聚，提高導(dǎo)向治療效果。 3.與單藥相比，131I—抗HBsAgFab聯(lián)合131I—chTNT瘤內(nèi)注射，放射性核素能更持久的存在于腫瘤組織，具有更強(qiáng)的腫瘤殺傷能力。 第二部分：索拉非尼對131I—TNT裸鼠體內(nèi)分布及抑制腫瘤生長能力的影響 方法： 1.建立入

8、肝癌細(xì)胞HepG2裸鼠皮下移植瘤模型：0.2ml(含活細(xì)胞2×106)人肝癌HepG2細(xì)胞(對數(shù)生長期)懸液接種裸鼠，注射部位為裸鼠右腋下部皮下。待裸鼠成瘤后剝?nèi)×鲶w周圍魚肉狀組織(活性好)為瘤源，分割成1-2cm3小塊，種植于裸鼠右側(cè)腋窩下部皮下。 2.131I標(biāo)記chTNT(方法同第一章)。 3.索拉非尼對腫瘤微血管生成的作用及對131I—chTNT裸鼠體內(nèi)分布的影響；將33只荷瘤雄性BALB/c裸鼠隨機(jī)分為3組，第

9、一組12只，按40mg/kg給予sorafenib灌胃，第二組12只、第三組9只，均給予同等劑量生理鹽水灌胃，持續(xù)14天。第15天于第一組和第二組各取3只裸鼠，處死，取出皮下瘤，免疫組織化學(xué)法行移植瘤微血管密度(MVD)檢測。余下裸鼠均給予131I—chTNT14.8MBq/40ul，瘤內(nèi)注射后，第二組按40mg/kg給予sorafenib灌胃，其他兩組給予同等劑量生理鹽水。瘤內(nèi)注射131I—chTNT后第1、4、7天每組各取三只裸鼠，

10、行放射免疫顯像后脫頸處死，取出每只裸鼠瘤體、心、肝、腎、血、肺和脾，分別稱取重量(g)，并放入井型定標(biāo)儀中測量放射性計(jì)數(shù)(D)，計(jì)算每克組織的放射性計(jì)數(shù)(D/g)，并計(jì)算瘤/非瘤(T/NT)比值。 4.索拉非尼聯(lián)合131I—chTNT對裸鼠移植瘤的抑制作用：25只荷瘤裸鼠分為5組，每組5只。①sorafenib組：sorafenib，40mg/kg，0.1ml灌胃，持續(xù)14天+瘤內(nèi)注射生理鹽水40uld1；②chTNT組：131

11、I—chTNT14.8MBq/40ul，瘤內(nèi)注射d1+0.1ml生理鹽水灌胃，持續(xù)14天；③序貫聯(lián)合組：sorafenib，40mg/kg，0.1ml，持續(xù)14天后瘤內(nèi)注射131I—chTNT14.8MBq/40ul；④同時(shí)聯(lián)合組：sorafenib，40mg/kg，0.1ml持續(xù)14天+瘤內(nèi)注射131I—chTNT14.8MBq/40uldl；⑤對照組：生理鹽水0.1ml灌胃，持續(xù)14天+生理鹽水40ul瘤內(nèi)注射，dl。觀察裸鼠移植瘤

12、生長情況，4周后處死裸鼠，稱重并測量瘤體積，計(jì)算腫瘤抑制率，并行病理形態(tài)學(xué)觀察。 5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，定量資料數(shù)據(jù)以—X±S表示，兩處理組MVD的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；抗體在裸鼠體內(nèi)T/NT比值比較和用藥前后對照組與各處理組移植瘤體積比較采用重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Welch和Tambane'sT2檢驗(yàn)，P≤0.05為差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：