不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)中Tim-3-Gal-9通路介導(dǎo)的免疫失衡機(jī)制研究.pdf

1、第一部分Tim-3和Gal-9在小鼠母胎界面的表達(dá)
　　【目的】
　　檢測(cè)Tim-3和Gal-9在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型母胎界面的表達(dá),探討Tim-3-Gal-9通路與不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)的聯(lián)系。
　　【方法】
　　1.將CBA/J雌鼠分別與DBA/2、BALB/c雄鼠2:1合籠,分別構(gòu)建小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型。
　　2.采用Western blot、Real-Time PCR和流式細(xì)胞術(shù)

2、檢測(cè)小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型胎盤組織Tim-3和Gal-9的表達(dá)。
　　3.采用免疫組織化學(xué)、Westernblot、Real-TimePCR和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型蛻膜組織Tim-3和Gal-9的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1.小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型造模成功。
　　2.小鼠自然流產(chǎn)模型胎盤組織中Tim-3蛋白和mRNA的表達(dá)高于正常妊娠模型,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3、
　　3.小鼠自然流產(chǎn)模型的滋養(yǎng)細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百分比高于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　4.Tim-3在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型蛻膜組織中均有表達(dá),且主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜,小鼠自然流產(chǎn)模型蛻膜組織Tim-3蛋白表達(dá)水平高于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而兩組模型蛻膜組織Tim-3mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　5.①小鼠自然流產(chǎn)模型和正常

4、妊娠模型的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　?、谛∈笞匀涣鳟a(chǎn)模型的蛻膜腺上皮細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百分比高于小鼠正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　?、坌∈笞匀涣鳟a(chǎn)模型的蛻膜淋巴細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百分比低于小鼠正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型胎盤組織中Gal-9mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。<

5、br>　　7.小鼠自然流產(chǎn)模型的滋養(yǎng)細(xì)胞Gal-9+細(xì)胞百分比低于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　8.Gal-9在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型蛻膜組織中均有表達(dá),且主要表達(dá)在細(xì)胞胞漿和細(xì)胞膜,小鼠兩組模型蛻膜組織中Gal-9蛋白和mRNA的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　9.①小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞Gal-9+細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　

6、?、谛∈笞匀涣鳟a(chǎn)模型的蛻膜腺上皮細(xì)胞Gal-9+細(xì)胞百分比低于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　?、坌∈笞匀涣鳟a(chǎn)模型的蛻膜淋巴細(xì)胞Gal-9+細(xì)胞百分比低于正常妊娠模型,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　【結(jié)論】
　　Tim-3和Gal-9在小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型的母胎界面均有表達(dá),且當(dāng)Tim-3和/或Gal-9表達(dá)異常時(shí),可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)。
　　第二部分體外研究Tim-3-

7、Gal-9通路對(duì)淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制
　　【目的】
　　將小鼠脾臟淋巴細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞分別與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng),以探討Tim-3-Gal-9通路對(duì)淋巴細(xì)胞免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。
　　【方法】
　　1.用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型脾臟淋巴細(xì)胞及外周血淋巴細(xì)胞的Tim-3和Gal-9表達(dá)。
　　2.采用ELISA檢測(cè)小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型血清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-

8、2,Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)。
　　3.將小鼠自然流產(chǎn)模型和正常妊娠模型脾臟淋巴細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞分別與各自的滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng),于共培養(yǎng)的第0、1、2、3、4、5、6、8、10天采用CFSE標(biāo)記法檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況,同時(shí)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞上Tim-3和Gal-9的表達(dá),并分別于共培養(yǎng)的第1、3、6、10天采用ELISA檢測(cè)共培養(yǎng)體系上清中Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2,Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)。

9、　　【結(jié)果】
　　1.小鼠自然流產(chǎn)模型的外周血淋巴細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百分比高于正常妊娠模型,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);小鼠自然流產(chǎn)模型的外周血淋巴細(xì)胞Gal-9+細(xì)胞百分比低于正常妊娠模型,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組模型的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百分比和Gal-9+細(xì)胞百分比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　2.小鼠自然流產(chǎn)模型血清中Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的表達(dá)比正常妊

10、娠模型低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組模型血清中Th2型細(xì)胞因子IL-4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　3.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞增殖率于第1~10天均明顯低于正常妊娠模型,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外周血淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系結(jié)果與脾臟淋巴細(xì)胞相同(P<0.05)。
　　4.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中脾臟淋巴細(xì)胞Tim-3+細(xì)胞百

11、分比與正常妊娠模型相比先升高然后逐漸降低,分別于第1天和第5天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外周血淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系結(jié)果與脾臟淋巴細(xì)胞相同,分別于第0、1天和第5、6天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中脾臟淋巴細(xì)胞Gal-9+細(xì)胞百分比與正常妊娠模型相比先下降然后逐漸升高,分別于第1、4、5、6天和第8天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);外周血淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)

12、細(xì)胞共培養(yǎng)體系結(jié)果與脾臟淋巴細(xì)胞相同,分別于第0、3天和第6天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　6.小鼠自然流產(chǎn)模型脾臟淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系上清中Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的表達(dá)高于正常妊娠模型,且于第6天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),Th2型細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)低于正常妊娠模型,且于第1、3、6天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。小鼠自然流產(chǎn)模型外周血淋巴細(xì)胞-滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中IL-2和IFN-