水稻稻瘟病抗性基因保守結(jié)構(gòu)的工程抗病性.pdf

1、水稻是我國重要的糧食作物，水稻的產(chǎn)量關(guān)乎著國家的糧食安全。在水稻生長過程中，經(jīng)常會受到水稻病害的脅迫，影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。稻瘟病是水稻三大病害之一，可在水稻生長的任何時期發(fā)病，輕者使水稻減產(chǎn)，嚴(yán)重時可以造成水稻的絕收。利用水稻稻瘟病抗性基因，使用基因工程手段獲得對稻瘟病具有廣譜、高效、持久抗性的品種（系），是防控稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。
　　研究表明，植物的抗性基因大多編碼CC/TIR-NB-LRR蛋白，通常是由C端的LRR

2、識別效應(yīng)分子，從而使LRR結(jié)構(gòu)域與NB-ARC結(jié)構(gòu)域互作，改變核苷酸綁定區(qū)域的位置和構(gòu)象，從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)原始信號，最后通過N端的CC結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)下游的免疫反應(yīng)。但是在對亞麻銹病抗性蛋白L6和L7的TIR結(jié)構(gòu)域研究中發(fā)現(xiàn)，其TIR結(jié)構(gòu)域足夠觸發(fā)細(xì)胞死亡反應(yīng)和介導(dǎo)免疫反應(yīng)。同樣大麥白粉病抗性蛋白MLA10，其CC結(jié)構(gòu)域都含有一個高度保守的EDVID基序，單獨(dú)的CC結(jié)構(gòu)域或者包含CC結(jié)構(gòu)的MLA10片段，都可以產(chǎn)生免疫自激活現(xiàn)象。CC結(jié)構(gòu)域自

3、激活現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為基因設(shè)計提供了一個新的思路。水稻稻瘟病抗性基因也是編碼CC/TIR-NB-LRR蛋白，但是從來沒有關(guān)于水稻稻瘟病抗性基因CC結(jié)構(gòu)域自激活的報道。
　　前期通過大量查閱文獻(xiàn)和對水稻稻瘟病R基因序列分析，選取了7個編碼CC-NB-LRR蛋白，并且CC結(jié)構(gòu)域都含有一個高度保守EDVID基序的稻瘟病抗性基因作為研究對象。通過結(jié)構(gòu)域的預(yù)測獲得7個R基因的CC結(jié)構(gòu)域，在煙草和水稻原生質(zhì)體中表達(dá)，只有Pi36基因的CC結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出

4、了自激活現(xiàn)象，明顯能夠觸發(fā)細(xì)胞死亡反應(yīng)。在擬南芥中異源表達(dá)Pi36CC增強(qiáng)擬南芥對白粉病的抗性。本研究基于Pi36基因的CC結(jié)構(gòu)域自激活的特性，在水稻中單獨(dú)表達(dá)Pi36CC，研究其自激活與水稻免疫反應(yīng)的關(guān)系，揭示水稻稻瘟病抗性基因介導(dǎo)免疫反應(yīng)的機(jī)制，探索通過基因工程獲得廣譜稻瘟病抗性的新途徑。得到了以下結(jié)果:
　　1、實驗使用稻瘟病誘導(dǎo)性啟動子PBZ1啟動子，選取水稻稻瘟病抗性基因Pi36的CC結(jié)構(gòu)域Pi36CC(1-134aa)

5、，并且加入標(biāo)記基因GFP，成功的構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300中，得到PBZ1∷Pi36CC(1-143)的水稻表達(dá)載體
　　2、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻粳稻品種TP309遺傳轉(zhuǎn)化，成功獲得了含有PBZ1∷Pi36CC(1-143)水稻表達(dá)載體的T0代陽性植株。在轉(zhuǎn)基因?qū)Ｓ锰镒匀粭l件繼代，并使用潮霉素篩選和目的基因PCR篩選的方法，得到了純合的轉(zhuǎn)基因種子。
　　3、對轉(zhuǎn)基因陽性植株接種常見稻瘟病菌，轉(zhuǎn)基因水稻表

6、現(xiàn)出明顯的稻瘟病抗性水平的提高。病斑數(shù)量和病斑大小的計數(shù)以及稻瘟病菌生物量和Pi36CC表達(dá)量的測定結(jié)果一致表明，在稻瘟病菌的誘導(dǎo)下PBZ1啟動子能夠啟動Pi36CC的表達(dá)，而且Pi36CC在水稻中表達(dá)，能夠明顯增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的抗性。
　　4、進(jìn)一步對抗性相關(guān)基因的表達(dá)量的測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻抗性相關(guān)基因OsPR1a和OsPR5以及PTI相關(guān)基因KS4和NCA4表達(dá)量明顯提高。說明Pi36CC能夠通過介導(dǎo)抗性相關(guān)基因表達(dá)量