水稻轉錄因子ZFP3調控水稻稻瘟病抗性的機制研究.pdf

1、稻瘟病是水稻的重大病害之一，屬于真菌病害。它發(fā)生于全世界各個水稻產區(qū)，其中以亞洲和非洲等主要稻區(qū)發(fā)病較為嚴重。在中國遍及各個稻區(qū)，一般山區(qū)重于平原，粳稻重于秈稻。稻瘟病發(fā)病時，水稻產量嚴重減產，甚至絕收。因此，防治稻瘟病一直以來是育種家和病理學家研究的熱點。目前，雖然防治稻瘟病的方法多樣，但選育抗病品種較其它各種防治方法，具有效果穩(wěn)定、安全和無公害等特點，是防治水稻稻瘟病的一條合理、高效和長遠的方法。而挖掘稻瘟病抗病相關基因是選育抗稻瘟

2、病品種的基礎。近年來，隨著測序技術和芯片技術等方面的發(fā)展，為發(fā)掘有效的稻瘟病抗病相關基因提供了堅實的基礎。
　　本研究中，利用稻瘟病感病材料麗江新團黑谷（麗江）和抗病材料地谷，在接種稻瘟病菌20 h時分別提取葉片RNA，利用芯片技術篩選出在抗感材料間差異表達的基因。在差異表達的基因中，篩選到了一個在麗江中顯著受稻瘟病菌誘導而在地谷中表達變化不顯著的基因。通過SMART軟件分析它的蛋白質結構，發(fā)現(xiàn)其含有兩個C2H2型鋅指結構，我們將

3、此基因命名為ZFP3。因為ZFP3在感病材料中受稻瘟病菌的誘導，因此，推測ZFP3是一個水稻抗稻瘟病的負調控因子。為了驗證這一假設，我們構建了基因ZFP3干涉的載體，并將其進行轉化到水稻材料臺北309中，通過病理學、細胞學和分子生物學等手段揭示ZFP3在水稻與稻瘟病菌互作過程中扮演的角色。研究結果如下:
　　1、基于芯片數(shù)據(jù)，篩選到一個在麗江接菌后顯著上調表達，而在地谷中無顯著變化的C2H2型鋅指蛋白基因ZFP3，并通過熒光定量P

4、CR技術(qRT-PCR)證實了ZFP3在芯片數(shù)據(jù)中的表達模式是正確的。
　　2、通過亞細胞定位實驗，發(fā)現(xiàn)ZFP3定位于水稻原生質的細胞核中。通過酵母單雜交技術(Yeast one-hybrid)實驗，發(fā)現(xiàn)ZFP3蛋白能結合C2H2型轉錄因子特異結合序列EP1S。由此表明ZFP3是一個轉錄因子。
　　3、在RGAP(Rice Gnome Annotation Project)數(shù)據(jù)庫中獲得基因ZFP3的CDS序列，通過序列Bl

5、ast，選取了ZFP3特異的片段作為基因ZFP3的目標干涉片段，構建了基因ZFP3的干涉載體，以臺北309為遺傳背景，通過遺傳轉化將ZFP3的干涉載體轉化到臺北309中，成功獲得了干涉ZFP3的轉基因陽性株系。
　　4、在轉基因陽性株系T2代中篩選到ZFP3基因干涉的純合株系，然后利用qRT-PCR檢測ZFP3的干涉程度，結果獲得兩個干涉顯著的轉基因株系。5、通過病理學實驗，發(fā)現(xiàn)ZFP3兩個顯著干涉的轉基因株系（ZFP3Ri2和Z

6、FP3Ri4）葉片上的病斑小于對照TP309葉片上的病斑。同時，利用qRT-PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)轉基因株系葉片上稻瘟病數(shù)量顯著少于對照TP309葉片上的，表明ZFP3是一個水稻抗稻瘟病的負調控因子。
　　6、將稻瘟病菌注射在葉鞘內，通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)基因ZFP3被干涉后，稻瘟病菌的附著孢發(fā)育遲緩。同時，發(fā)現(xiàn)當?shù)疚敛【z侵入水稻細胞后，基因ZFP3被干涉的水稻細胞能快速產生過敏反應，從而加速細胞死亡，以此阻止菌絲向鄰近細胞蔓延。<

7、br>　　7、通過DAB染色，發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌附著胞的位置，基因ZFP3被干涉的轉基因植株葉片上的過氧化氫積累比對照TP309葉片上的多。通過qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)基因ZFP3能夠正向調控活性氧降解相關基因的表達。當基因ZFP3的表達被干涉后，降解過氧化氫的基因的表達量也降低了，從而引起過氧化氫的積累，進而引發(fā)過敏反應。
　　8、水楊酸(Salicylic Acid, SA)與植物抗病相關，因此，我們也檢測了轉基因株系和對照材料T

8、P309中SA合成和信號傳導的相關基因的表達量，結果發(fā)現(xiàn)基因ZFP3干涉后，SA合成和信號傳導相關的部分基因的表達量升高了，表明ZFP3負調控SA合成和信號傳導的相關基因。因此，當ZFP3被干涉后，水稻產生了稻瘟病抗性。
　　綜上所述，基因ZFP3通過負調控SA合成和信號轉導的相關基因的表達，而正調控過氧化氫降解相關基因的表達，從而引起稻瘟病菌侵染水稻葉片位點處過氧化氫量的變化，以此影響稻瘟病菌附著胞發(fā)育進程和侵入菌絲的擴展，進而