水稻轉(zhuǎn)錄因子ZFP3調(diào)控水稻稻瘟病抗性的機(jī)制研究.pdf

1、稻瘟病是水稻的重大病害之一，屬于真菌病害。它發(fā)生于全世界各個(gè)水稻產(chǎn)區(qū)，其中以亞洲和非洲等主要稻區(qū)發(fā)病較為嚴(yán)重。在中國遍及各個(gè)稻區(qū)，一般山區(qū)重于平原，粳稻重于秈稻。稻瘟病發(fā)病時(shí)，水稻產(chǎn)量嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收。因此，防治稻瘟病一直以來是育種家和病理學(xué)家研究的熱點(diǎn)。目前，雖然防治稻瘟病的方法多樣，但選育抗病品種較其它各種防治方法，具有效果穩(wěn)定、安全和無公害等特點(diǎn)，是防治水稻稻瘟病的一條合理、高效和長遠(yuǎn)的方法。而挖掘稻瘟病抗病相關(guān)基因是選育抗稻瘟

2、病品種的基礎(chǔ)。近年來，隨著測(cè)序技術(shù)和芯片技術(shù)等方面的發(fā)展，為發(fā)掘有效的稻瘟病抗病相關(guān)基因提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　本研究中，利用稻瘟病感病材料麗江新團(tuán)黑谷（麗江）和抗病材料地谷，在接種稻瘟病菌20 h時(shí)分別提取葉片RNA，利用芯片技術(shù)篩選出在抗感材料間差異表達(dá)的基因。在差異表達(dá)的基因中，篩選到了一個(gè)在麗江中顯著受稻瘟病菌誘導(dǎo)而在地谷中表達(dá)變化不顯著的基因。通過SMART軟件分析它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其含有兩個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，我們將

3、此基因命名為ZFP3。因?yàn)閆FP3在感病材料中受稻瘟病菌的誘導(dǎo)，因此，推測(cè)ZFP3是一個(gè)水稻抗稻瘟病的負(fù)調(diào)控因子。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們構(gòu)建了基因ZFP3干涉的載體，并將其進(jìn)行轉(zhuǎn)化到水稻材料臺(tái)北309中，通過病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)等手段揭示ZFP3在水稻與稻瘟病菌互作過程中扮演的角色。研究結(jié)果如下:
　　1、基于芯片數(shù)據(jù)，篩選到一個(gè)在麗江接菌后顯著上調(diào)表達(dá)，而在地谷中無顯著變化的C2H2型鋅指蛋白基因ZFP3，并通過熒光定量P

4、CR技術(shù)(qRT-PCR)證實(shí)了ZFP3在芯片數(shù)據(jù)中的表達(dá)模式是正確的。
　　2、通過亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ZFP3定位于水稻原生質(zhì)的細(xì)胞核中。通過酵母單雜交技術(shù)(Yeast one-hybrid)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ZFP3蛋白能結(jié)合C2H2型轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合序列EP1S。由此表明ZFP3是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。
　　3、在RGAP(Rice Gnome Annotation Project)數(shù)據(jù)庫中獲得基因ZFP3的CDS序列，通過序列Bl

5、ast，選取了ZFP3特異的片段作為基因ZFP3的目標(biāo)干涉片段，構(gòu)建了基因ZFP3的干涉載體，以臺(tái)北309為遺傳背景，通過遺傳轉(zhuǎn)化將ZFP3的干涉載體轉(zhuǎn)化到臺(tái)北309中，成功獲得了干涉ZFP3的轉(zhuǎn)基因陽性株系。
　　4、在轉(zhuǎn)基因陽性株系T2代中篩選到ZFP3基因干涉的純合株系，然后利用qRT-PCR檢測(cè)ZFP3的干涉程度，結(jié)果獲得兩個(gè)干涉顯著的轉(zhuǎn)基因株系。5、通過病理學(xué)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)ZFP3兩個(gè)顯著干涉的轉(zhuǎn)基因株系（ZFP3Ri2和Z

6、FP3Ri4）葉片上的病斑小于對(duì)照TP309葉片上的病斑。同時(shí)，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系葉片上稻瘟病數(shù)量顯著少于對(duì)照TP309葉片上的，表明ZFP3是一個(gè)水稻抗稻瘟病的負(fù)調(diào)控因子。
　　6、將稻瘟病菌注射在葉鞘內(nèi)，通過顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)基因ZFP3被干涉后，稻瘟病菌的附著孢發(fā)育遲緩。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)疚敛【z侵入水稻細(xì)胞后，基因ZFP3被干涉的水稻細(xì)胞能快速產(chǎn)生過敏反應(yīng)，從而加速細(xì)胞死亡，以此阻止菌絲向鄰近細(xì)胞蔓延。<

7、br>　　7、通過DAB染色，發(fā)現(xiàn)在稻瘟病菌附著胞的位置，基因ZFP3被干涉的轉(zhuǎn)基因植株葉片上的過氧化氫積累比對(duì)照TP309葉片上的多。通過qRT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)基因ZFP3能夠正向調(diào)控活性氧降解相關(guān)基因的表達(dá)。當(dāng)基因ZFP3的表達(dá)被干涉后，降解過氧化氫的基因的表達(dá)量也降低了，從而引起過氧化氫的積累，進(jìn)而引發(fā)過敏反應(yīng)。
　　8、水楊酸(Salicylic Acid, SA)與植物抗病相關(guān)，因此，我們也檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照材料T

8、P309中SA合成和信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因ZFP3干涉后，SA合成和信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的部分基因的表達(dá)量升高了，表明ZFP3負(fù)調(diào)控SA合成和信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)基因。因此，當(dāng)ZFP3被干涉后，水稻產(chǎn)生了稻瘟病抗性。
　　綜上所述，基因ZFP3通過負(fù)調(diào)控SA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因的表達(dá)，而正調(diào)控過氧化氫降解相關(guān)基因的表達(dá)，從而引起稻瘟病菌侵染水稻葉片位點(diǎn)處過氧化氫量的變化，以此影響稻瘟病菌附著胞發(fā)育進(jìn)程和侵入菌絲的擴(kuò)展，進(jìn)而