調(diào)肝方藥對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷模型的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、本研究立足于以往研究基礎(chǔ)，結(jié)合目前國內(nèi)外的相關(guān)研究，在細(xì)胞和分子水平進(jìn)一步探討調(diào)肝方藥加味四逆散治療效應(yīng)的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)選用具有神經(jīng)元特性和功能的PC12 細(xì)胞，利用皮質(zhì)酮 (Cort)、谷氨酸 (Glu)作用于體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞作為研究模型，體外模擬抑郁癥病人出現(xiàn)的高糖皮質(zhì)激素(GC)水平及谷氨酸堆積狀態(tài)，運(yùn)用中藥血清藥理學(xué)方法、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、免疫印跡等方法，針對(duì)慢性心理應(yīng)激可導(dǎo)致對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷這一關(guān)鍵問題，觀察調(diào)肝治

2、法方藥加味四逆散含藥血清的藥物學(xué)效應(yīng)，從微觀方面闡明和揭示調(diào)肝治法方藥抗慢性應(yīng)激致神經(jīng)細(xì)胞損傷的機(jī)理，為今后研制開發(fā)抗抑郁癥中藥新藥提供理論依據(jù)。 本研究分為四部分： 第一部分加味四逆散含藥血清對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 本部分實(shí)驗(yàn)觀察調(diào)肝方藥加味四逆散(JWSNS)含藥血清對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸致PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。加味四逆散組方為柴胡5g、白芍15g、枳殼6g、枸杞子15g、山梔5g、干地

3、黃18g、石決明30g組成。實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄Wistar 大鼠，將動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、JWSNS低、中、高劑量組 (分別含生藥劑量0.846、1.69、3.384kg/L)。腹主動(dòng)脈取血，分離制備含藥血清。用倒置顯微鏡對(duì)培養(yǎng)的PC12細(xì)胞、皮質(zhì)酮、谷氨酸、JWSNS含藥血清作用PC12細(xì)胞24h后的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，用形態(tài)學(xué)方法證明PC12細(xì)胞培養(yǎng)成功。采用100、200、400μmol/L Cort、10、50、100μmol/LG

4、lu及5％、10％ JWSNS含藥血清分別與PC12細(xì)胞共同孵育24h，以MTT法測定細(xì)胞存活率，觀察不同濃度皮質(zhì)酮、谷氨酸及加味四逆散含藥血清對(duì)PC12細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/Lcort組細(xì)胞存活率分別為72.31％、53.85％、26.16％，10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 氨酸組細(xì)胞存活率分別為67.69％、43.32％、21.54％，不同濃度皮

5、質(zhì)酮和谷氨酸對(duì)PC12細(xì)胞的生長均具有抑制作用，隨著皮質(zhì)酮和谷氨酸的濃度升高，細(xì)胞存活率明顯降低，細(xì)胞損傷程度加重，與正常細(xì)胞對(duì)照組相比均有顯著性差異 (p<0.05-0.001)。5％JWSNS含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞存活率分別為86.76％、98.41％和94.11％，10％JWSNS含藥血清低、中、高劑量組細(xì)胞存活率分別為85.29、97.06％和89.71％， 50石、10％正常血清組細(xì)胞存活率分別為92.65％和88.24

6、％，與正常細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞存活率相比均無差異(p>0.05)。表明加味四逆散含藥血清對(duì)正常PC12胞無毒副作用。 第二部分加味四逆散含藥血清對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及對(duì)BDNF 蛋白表達(dá)的影響 本實(shí)驗(yàn)用形態(tài)法、Annexin V/PI 雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)觀察加味四逆散含藥血清對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞對(duì)照組、200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷模型組

7、、200μmol/LCort、50μmol/L G1u 損傷+10％JWSNS 含藥血清組、200μmol/L Cort、50μmol/L G1u 損傷+10％正常血清組。用吖啶橙(AO)和Hoechst33342(Ho)熒光染色觀察皮質(zhì)酮、谷氨酸致PC12細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；在熒光顯微鏡下可見AO染色后活細(xì)胞的細(xì)胞核呈亮綠色，死亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈暗綠色，胞質(zhì)整個(gè)呈暗綠色。Hoechst 33342染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色，活細(xì)胞的藍(lán)色熒光最

8、強(qiáng)，而早期凋亡細(xì)胞藍(lán)色熒光較弱。以細(xì)胞萎縮、核固縮、染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成和熒光強(qiáng)度增強(qiáng)等作為凋亡細(xì)胞指征，與正常組細(xì)胞相比，皮質(zhì)酮和谷氨酸組細(xì)胞生長狀態(tài)較差，多見核染色質(zhì)濃縮密集，邊緣化，形成深染團(tuán)塊呈新月狀或戒指狀，位于核膜下，核破裂出芽形成凋亡小體等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及死亡細(xì)胞；含藥血清組細(xì)胞生長狀態(tài)較好，少見凋亡和死亡細(xì)胞形態(tài)。 采用Annexin V/PI雙標(biāo)流式細(xì)胞術(shù)檢測PC12細(xì)胞凋亡率，可見正常細(xì)胞組細(xì)胞凋亡

9、率為(16.24±0.78)％，200μmol/LCort、50μmol/L G1u損傷模型組細(xì)胞凋亡率分別為(45.91±0.95)％，(39.58±0.7)％，與正常細(xì)胞對(duì)照組相比明顯升高(p<0.001)，表明皮質(zhì)酮、谷氨酸可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生早期凋亡。200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+10％JWSNS含藥血清組細(xì)胞凋亡率均下降，其中中劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(28.99±1.20)％、(23.89±0.

10、35)％，高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(31.82±2.04)％、 (29.84±0.97)％，與200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷模型組比較差異有顯著性(p<0.05-0.01)，200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+10％JWSNS 含藥血清組中、高劑量組細(xì)胞凋亡率明顯低于200μmol/LCort、50μmol/LGlu損傷+10％正常血清組(p<0.05-0.01)，表明加味四逆散含藥血清具

11、有減少皮質(zhì)酮、谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的作用。200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+10％正常血清組細(xì)胞凋亡率與200μmol/LCort、50μmol/L G1u損傷模型組比較無顯著差異，表明正常大鼠血清無抗皮質(zhì)酮、谷氨酸誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的作用。 第三部分加味四逆散含藥血清對(duì)皮質(zhì)酮、谷氨酸致PC12細(xì)胞胞內(nèi)[Ca<'2+>]i的影響 本研究采用激光共聚焦顯微鏡觀察加味四逆散含藥血清對(duì)皮質(zhì)酮、谷

12、氨酸致PC12細(xì)胞內(nèi)[Ca<'2+>]i的影響。實(shí)驗(yàn)分為正常細(xì)胞組、200μmol/L,Cort、50μmol/L G1u損傷模型組、200μmol/LCort、50μmol/L Glu損傷+含藥血清組，200μmol/LCort、50μmol/L G1u損傷+正常血清組。以Fluo-3/AM(5 u mol/L)探針裝載液，在激光顯微鏡下取不同視野選擇神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行掃描。結(jié)果表明正常PC12細(xì)胞普遍為低熒光強(qiáng)度細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度為5

13、3.6±7.9：200μmol/LCort、50μmol/L Glu 損傷模型組PC12細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，分別達(dá)到134.9±12.1、162.3±5.3，胞內(nèi)鈣離子濃度明顯升高(p<0.001)；與皮質(zhì)酮、谷氨酸組相比，200μmol/LCort、50μmol/LGlu 損傷+含藥血清組細(xì)胞熒光強(qiáng)度均明顯減弱，并且弱于正常血清組，其中中劑量組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值分別為64.7±4.8、69.7±6.7，與皮質(zhì)酮、谷氨酸和正常大鼠血清

14、組相比有顯著性差異(p<0.01-0.001)。表明皮質(zhì)酮、谷氨酸可致PC12細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，使PC12細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣超載；調(diào)肝方藥加味四逆散含藥血清具有緩解皮質(zhì)酮、谷氨酸所致PC12細(xì)胞胞內(nèi)鈣超載的效應(yīng)。 第四部分加味四逆散含藥血清對(duì)轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)及其磷酸化 (P-CREB)的影響 本研究采用免疫組織化學(xué)方法、Western blot法分別檢測加味四逆散含藥血清對(duì)CREB及其磷酸化(P

15、-CREB)的影響。 本研究采用了細(xì)胞和分子生物學(xué)方法探討了調(diào)肝方藥加味四逆散對(duì)細(xì)胞損傷模型PCI2細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，以證實(shí)肝主疏泄調(diào)暢情志功能的神經(jīng)生物學(xué)分子機(jī)制，研究結(jié)果提示，加味四逆散含藥血清對(duì)谷氨酸、皮質(zhì)酮所致PC12細(xì)胞損傷具有顯著保護(hù)作用，可提高皮質(zhì)酮、谷氨酸誘導(dǎo)凋亡的PC12細(xì)胞BDNF的表達(dá)，具有緩解皮質(zhì)酮、谷氨酸所致PC12細(xì)胞胞內(nèi)鈣超載的效應(yīng)，以中劑量組效應(yīng)最強(qiáng)。加味四逆散含藥血清能上調(diào)CREB的磷酸化水平，上